Trichoderma reesei: New insights into gene regulation and potential use as cell factory

Abstract

Der filamentöse Ascomyzet Trichoderma reesei ist vor allem für seine großartigen Eigenschaften in der industriellen Produktion von Proteinen bekannt. Trichoderma reesei wird vor allem für die industrielle Produktion von Zellulasen, Hemizellulasen und anderen biopolymer-abbauenden Enzymen eingesetzt. Daher wurden in der vorliegenden Arbeit die folgenden Themen behandelt, um weitere Einblicke in die Regulation der Genexpression und den möglichen Einsatz von Trichoderma reesei als Zellfabrik zu erhalten. Die Regulation der Zellulase- und Hemizellulase-codierenden Gene wird von verschiedenen unterschiedlichen Transkriptionsfaktoren beeinflusst. Um die Induktionsmuster der Proteinexpression zu verstehen ist die Untersuchung von Protein-DNA-Interaktionen in vivo von größter Bedeutung. Daher verbesserten wir die traditionelle Methode des "in vivo footprinting", um eine reproduzierbare, stabile und zuverlässige Methode für die Identifikation von Protein-DNA-Interaktionen zu erhalten. In Kombination mit der neuen computerunterstützten, automatisierten Datenanalyse gewährleistet dieser Ansatz eine objektive Auswertung von Hochdurchsatzprojekten. Eine einzige Punktmutation im Transaktivator Xyr1 führt zu einer Deregulation der Xylanaseexpression, während die Induktion der Zellulaseexpression weiterhin durch Sophorose induzierbar bleibt. CD-Analysen von Xyr1 und Xyr1A824V zeigen eine Änderung der Sekundärstruktur und einen Verlust der Strukturänderung als Reaktion auf die Gegenwart bestimmter Zuckermoleküle nahe. Diese Ergebnisse legen den Schluss nahe, dass Xyr1 eine sogenannte "nuclear Rezeptor" - ähnliche Domäne besitzt. Trichoderma reesei ist ein wichtiger industrieller Produzent von hydrolytischen Enzymen. Daher wäre auch ein Einsatz als Zellfabrik denkbar. Daher wurde zum ersten Mal die heterologe Expression einer bakteriellen Zwei-Enzymkaskade in Trichoderma reesei durchgeführt. Das Ziel war die Produktion von N-Acetylneuraminsäure, einem wertvollen Rohstoff für die pharmazeutische Industrie, durch Fermentation auf kolloidalem Chitin, einem billigen und ergiebigen Rohstoff.

The filamentous ascomycete Trichoderma reesei is known for its high protein production and secretion capabilities. In industry Trichoderma reesei has been used extensively for the production of cellulases, hemicellulases, and other biopolymer-degrading enzymes. Therefore, the following topics were addressed in order to obtain further insights into gene regulation and the potential use of Trichoderma reesei as a cell factory. The regulation of cellulase- and hemicellulase-encoding genes is subject to a number of different transcription factors. In order to understand the induction patterns responsible the study of protein-DNA interactions in vivo is highly relevant. Therefore we improved traditional in vivo footprinting to obtain a reproducible, stable and reliable method to identify protein-DNA interaction events. The combination with automated data analysis ensures objective evaluation of high-throughput projects. A single point mutation in Xyr1 was shown to cause strong deregulation of xylanase expression, while cellulase expression remained inducible by sophorose. CD analysis of the wild-type Xyr1 and Xyr1A824V suggests a change in secondary structure as well as loss of structural response to the carbohydrate present. This points towards the presence of a nuclear receptor-like domain in Xyr1. Trichoderma reesei is an important industrial producer of hydrolytic enzymes, which suggests the potential use of Trichoderma reesei as cell factory. For the first time the heterologous expression of a bacterial two-enzyme cascade was attempted, which resulted in the production of N-acetyl neuraminic acid, a valuable chemical for the pharmaceutical industry, through fermentation of colloidal chitin, a cheap and abundant carbon source.