Different approaches to make Pichia pastoris a more versatile expression platform - process, strain and product engineering

Abstract

Zusammenfassung Im Laufe der letzten Jahrzehnte etablierte sich der biopharmazeutische Markt als wichtiges Element des globalen pharmazeutischen Marktes. Zu den wichtigsten biopharmazeutischen Produkten zählen Antikörper aber auch Antikörperfragmente. Jedoch werden Protein und auch Enzyme zunehmend interessanter und wichtiger. Aufgrund der Fähigkeit menschenähnliche Glykosylierungsstrukturen auszubilden, sind Säugetierzellen die am weitest verbreitetsten Expressionssysteme für die Produktion von Biopharmazeutika. Jedoch würde die Verwendung von weniger komplexen Mikroorganismen wie Bakterien oder Hefen eine Vereinfachung des Upstream-Prozesses und außerdem eine Verbesserung der Produktivität bewirken. Ein bereits weit verbreiteter Organismus, welcher sowohl für die industrielle als auch für die biopharmazeutische Enzym-Produktion verwendet wird, ist die methylotrophe Hefe P. pastoris. Zu ihren Vorteilen zählen unter anderem die Fähigkeit in hohen Zelldichten zu wachsen, die Einfachheit der genetischen Manipulation, die Verfügbarkeit von starken, streng regulierten Promotoren und die Fähigkeit sowohl intrazelluläre als auch extrazelluläre rekombinante Proteine bis in Gram pro Liter zu produzieren. Nichtsdestotrotz ist die Implementierung dieses Host-Organismus in der biopharmazeutischen Produktion nicht gut etabliert. Vorwiegend wegen des Fehlens der menschenähnlichen posttranslationalen Modifikationen, allen voran der Glykosylierung. Außerdem schreckt die Verwendung von Methanol als Inducer-Substrat ab. Methanol ist ein starkes Reduktionsmittel mit hohem Sauerstoffverbrauch und starker Hitzeentwicklung. Deshalb ist die Substitution von Methanol durchein anderes Substrat sehr wünschenswert. Die Hyper-Glykosylierung, welche durch Hefen verursacht wird, führt zur Produktion von nicht human glykosylierten Proteinen. Dies ist einer der Gründe derartige Proteine nicht als Biopharmazeutika zu verwenden. Außerdem hindern die uneinheitlichen Glykosylierungsstrukturen ein effizientes Downstream Processing. Das Ziel dieser Arbeit ist es daher die genannten Probleme zu lösen und P. pastoris zu einem geeigneten und attraktiveren Expressionssystem für Biopharmazeutika zu machen. Um dies umzusetzen, wurden die Engineering Methoden Prozessentwicklung, Stamm-Engineering und Produkt-Engineering angewandt. Das erste Kapitel -The biopharmaceutical market- gibt einen Überblick über den pharmazeutischen Markt und die neuesten Fortschritte im Bereich von Expressionssystemen, Stamm-Entwicklung und Produktion mit den drei wichtigsten Mikroorganismen (Saccharomyces cerevisiae, P. pastoris und Escherichia coli) für die Herstellung von Antikörper Fragmenten. Im zweiten Kapitel der Arbeit, -Avoiding methanol requirement- beschreibe ich eine Prozess-Engineering Methode basierend auf einer gemischten Fütterungsstrategie zur Optimierung der rekombinanten Expression des Phospholipase C Enzyms (PLC) in einem P. pastoris Stamms, welcher eine AOX1 Depressionspromoter-Variante trägt. Durch Verwendung dieses P. pastoris Stamms ist es möglich Methanol als Inducer zu umgehen. Das dritte Kapitel -Reducing hyperglycosylation- beschreibt die zwei Methoden Stamm- und Produkt-Glycoengineering, welche dazu verwendet wurden um die Hyperglykosylierung der Hefe zu reduzieren. Beide Methoden wurden angewandt, um gleichmäßiger und weniger glykosylierte Isovarianten des Enzyms Horseradish Peroxidase (HRP) zu expremieren. Da HRP ein Häm-Gruppen enthaltendes Enzym ist, wurden zwei verschiedene Methoden (metabolisches Engineering und Cofaktorzusatz zum Medium) verwendet und verglichen, um die Häm-Verfügbarkeit zu steigern. Die Ergebnisse werden im vierten Kapitel -Increasing product specific cofactor availability- beschrieben. Die Methode der Überexpression von Häm-Pathway-Genen wurde mit Kultivierungen verglichen, denen Hemin in das Wachstumsmedium zugesetzt wurde, indem die endgültigen Mengen an aktiver HRP ermittelt wurden. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass wir die geeignetste Engineering-Methode ermitteln konnten um die zu Anfangs erwähnten Probleme bzw. Aufgaben zu lösen: - Es war möglich einen De-repressionsstamm in einen Prozess zu implementieren um Methanol als Inducer zu vermeiden. - Es konnte gezeigt werden, dass Glycoengineering des Produkts eine wirksame Methode ist, um die Hypergylkosylierung des Enzyms zu reduzieren. - Die Medien-Zusammensetzung zu verändern ist eine mögliche Strategie, um die produktspezifische Cofaktor-Verfügbarkeit zu erhöhen. Aufgrund der genannten Ergebnisse kann diese Arbeit als fundamentale Erkenntnis für eine erfolgreiche Expression von rekombinanten Biopharmazeutika in P. pastoris gesehen werden.

1.Abstract Over the last decades, the biopharmaceutical market has become a significant segment of the global pharmaceutical market, with antibodies and antibody fragments being the leading building blocks. However, also proteins and enzymes are conquering the biopharmaceutical market now. Mainly due to the possibility of resembling human-like glycosylation, mammalian cells are still the most widely used expression system for the production of biopharmaceuticals. However, implementation of less complex microorganisms, such as yeasts or bacteria, would be highly desirable to simplify the upstream processes and improve productivity. The methylotrophic yeast P. pastoris is commonly used for the production of industrial and biopharmaceutical enzymes. This yeast offers many advantages such as biomass growth up to very high cell density, easiness of genetic manipulation, availability of strong and tightly regulated promoters and the possibility of producing up to gram per litre of recombinant protein, both intracellularly and extracellularly. Nevertheless, its implementation for biopharmaceuticals production is not well established yet, mainly due to the need of circumventing methanol implementation as induction substrate and due to the distance from the native human-like post-translational modifications, above all glycosylation. Methanol is a high-degree reductant with high heat of combustion and high oxygen consumption. Therefore its replacement with a different substrate is highly desirable above all for large scale fermentations. Yeast hyperglycosylation leads to the production of non-human like glycosylated proteins thus limiting their implementation as biopharmaceuticals. Additionally, the presence of non-uniform glycoforms hampers downstream processing and conjugation approaches. Therefore the goal of this Thesis consists in solving the above mentioned issues with the aim of rendering P. pastoris a more suitable expression host for production of biopharmaceuticals. In compliance with the goal of this Thesis, the following methodology based on the application of three different engineering methods namely, process, strain and product engineering was applied. In the first chapter of this Thesis, -The biopharmaceutical market-, an overview is provided about this branch of the pharmaceutical market and the recent advances with the three main microbials, namely Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris and Escherichia coli for full length antibodies and antibody fragments production. In the second chapter of this Thesis, -Avoiding methanol requirement- I describe a process engineering approach based on the design of a mixed-feed strategy for optimizing the recombinant expression of phospholipase C enzyme (PLC) in a P. pastoris strain harbouring an AOX1 de-repression promoter variant. Using this strain methanol as inducer can be omitted. In the third chapter -Reducing hyperglycosylation- I describe two different engineering approaches, namely strain and product glycoengineering, which can be applied to reduce yeast hyperglycosylation. These methods were tested for the expression of a more uniformly and less glycosylated horseradish peroxidase (HRP) isovariants. Since HRP is a heme containing enzyme, I describe and compare two different approaches based on metabolic engineering and on cofactor media supplementation for enhancing heme availability, as described in the third chapter of this Thesis -Increasing product specific cofactor availability-. Over-expression of heme pathway genes versus hemin supplementation in growth media was tested for improving final yields of active HRP. In conclusion, in compliance with the described methodology, I was able to identify the most suitable engineering approach to be applied for solving each of the above mentioned pitfalls. In particular I found out that: - process engineering in combination with implementation of a de-repressed strain allows to circumvent methanol implementation; - product glycoengineering proves to be a valid strategy for reducing enzyme hyperglycosylation; - cofactor supplementation in media proves to be a valid approach to increase product specific cofactor availability. Therefore the presented Thesis represents a basis for the combination of these engineering approaches and may work as fundamental knowledge for successful expression of recombinant biopharmaceuticals in P. pastoris.