Hochaufgelöste korrelative Mikrosokopie anhand des Modellorganismus Arabidopsis Thaliana

Abstract

Korrelative Bildgebung ist eine Methode, bei der zwei oder mehr komplementäre Bildgebungsverfahren verwendet werden, um Informationen über eine Probe zu sammeln. Dadurch kann ein ganzheitliches Bild der Probe erzeugt werden, in welchem die gesamte relevante Informationsund Auflösungsspanne genutzt wird. Das Ziel dieses Projekts war, eine Methode zu entwickeln, die die Mikroskopiemethoden direct Stochastical Reconstruction Microscopy (dSTORM) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) miteinander korreliert und genutzt werden kann, um Autophagie in Pflanzen zu erforschen. Autophagie ist ein essentieller Mechanismus, der in biologischen Zellen vorkommt und Teil der Qualitätskontrolle der Zelle ist. Sie gewährleistet das Entfernen von unerwünschten oder überschüssigen Makromolekülen, die der Zelle potentiell schaden könnten. Während des Prozesses werden diese Makromoleküle von neu gebildeten, doppelmembranigen Vesikeln verschlungen, welche Autophagosomen genannt werden. Autophagosomen sind durch das Protein ATG8 (engl. autophagy-related protein 8) gekennzeichnet, welches für die Bildung der autophagosomalen Membran benötigt wird. Der Hauptfokus dieses Projekts war die Entwicklung und Optimierung von Probenvorbereitungsprotokollen, um die Kompatibilität zwischen den verschiedenen Fluoreszenzund Elektronenmikroskopiemethoden (dSTORM und TEM) zu gewährleisten, und einer Strategie, um dieselbe Stelle mit den zwei verschiedenen Methoden zu detektieren. Wir haben die Verteilung von einzelnen ATG8-Proteinen mit dSTORM visualisiert und die Ultrastruktur von isolierten Zellkernen mit Autophagosomen mit TEM aufgelöst.

Correlative imaging is a method used to gather information about a specimen by applying two or more complementary modalities. This allows to span the entire information and resolution range of interest and create a holistic view of the sample. This project aimed at developing a method to study autophagy in plants by correlating direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (dSTORM) and Transmission Electron Microcopy (TEM). Autophagy is an essential quality control mechanism that appears in biological cells. It ensures removal of unwanted or excess macromolecules that could otherwise cause harm to the cell. During this process, these macromolecules get engulfed by newly-formed double membrane vesicles termed autophagosomes. They are labeled by the autophagy-related protein 8 (ATG8) that is required for the formation of the autophagosomal membrane. The main focus of this project was the establishment and optimization of sample preparation protocols to ensure compatibility between fluorescence and electron microscopy techniques (dSTORM and TEM), and the identification of labeling strategies that allow to detect the same region of interest with the two different modalities. We visualized the distribution of ATG8 at a single-molecule level using dSTORM, and the ultrastructure of isolated nuclei with autophagosomes using TEM.