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Title
Novel strategies and methods for the development of glycosidase responsive fluorogenic probes / von Stefan Lexmüller
Additional Titles
Neue Strategien und Methoden zur Entwicklung von Glycosidase sensitiven fluorogenen Substraten
AuthorLexmüller, Stefan
Thesis advisorMikula, Hannes
PublishedWien, 2018
Descriptionv, 167, XXV Seiten : Illustrationen, Diagramme
Institutional NoteTechnische Universität Wien, Dissertation, 2018
Annotation
Zusammenfassung in deutscher Sprache
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Abweichender Titel nach Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers
LanguageEnglish
Document typeDissertation (PhD)
Keywords (EN)Glycosidase Responsive Fluorogenic Probes
URNurn:nbn:at:at-ubtuw:1-112048 Persistent Identifier (URN)
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 The work is publicly available
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Novel strategies and methods for the development of glycosidase responsive fluorogenic probes [32.19 mb]
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Abstract (German)

Monitoring der Qualität von Oberflächen-, Industrie-, Abfall- und Trinkwasser ist ein entscheidender Aspekt der Umweltüberwachung, da Wasser die Umweltqualität direkt beeinflusst. Ein wichtiger Teil dieses Monitorings ist die Untersuchung bakterieller Belastungen, welche mit einer Vielzahl von Methoden einschließlich spezifischer bakterieller Enzyme durchgeführt werden können. Für diese Assays ist die Verwendung von fluorogenen Enzymsubstraten weltweit üblich. Klassische Methoden können jedoch aufgrund von bis zu 72 stündigen Inkubationszeiten zeitaufwendig sein und dadurch rasche und unmittelbare Reaktionen auf umweltbedingte Gesundheitsrisiken verzögern. Des Weiteren können inkubationsbedingt Bakterienstämme überrepräsentiert auftreten und dadurch Ergebnisse verfälscht werden. Im letzten Jahrzehnt wurden deshalb Echtzeit Fluoreszenz Assays (QRTF) entwickelt, welche keine Inkubation der Proben benötigen. Um ihr Potential gänzlich ausschöpfen zu können, ist die Entwicklung neuer fluorogener Substrate notwendig. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zunächst die Probleme des am häufigsten verwendeten Substrates 4-Methylumbellieron Glucuronid während QRTF Assays untersucht. Die daraus erhaltenen Erfahrungswerte führten anschließend zur Herstellung und Applikation neuer Enzymsubstrate. In diesen Substraten wurden selbstzerstörende Linker eingesetzt, um den Zugang zu neuen Fluorophoren und Fluoreszenz- Resonanzenergietransfer (FRET) Mechanismen zu ermöglichen. Es wurde ein neues Messgerät (SRM) entwickelt, das die Auslagerung der enzymatischen Reaktion aus der Messkammer ermöglicht. Durch diese räumliche Trennung konnte das Hintergrundfluoreszenzsignal drastisch reduziert und dadurch die Sensitivität des Assays erheblich gesteigert werden. Zusammengefasst entwickelt diese Arbeit innovative und schnelle Methoden für die Untersuchung bakterieller Belastung von biologischen Systemen.

Abstract (English)

Monitoring the quality of surface, industrial, waste and drinking water is a crucial aspect of environmental monitoring since the water quality directly influences the quality of life. An important part of water monitoring is the investigation of the bacterial load, which can be conducted by a variety of methods including enzyme assays of highly specific bacterial enzymes. The usage of artificial fluorogenic enzyme substrates (fluorognic probes) for these assays is now commonly in place in laboratories worldwide. However, traditional methods of identifying bacteria can be time consuming as they involve incubation times up to 72 hours. This high incubation time can be problematic as often fast definitive answers are required on environmental health risks. Furthermore, incubation methods can be misleading as not all bacterial strains are equally represented. In the last decade quantitative real time fluorescence (QRTF) assays have been developed without the need of incubation. However, this technology also requests more sophisticated fluorogenic enzyme substrates, as commonly used substrates limit the capabilities of QRTF measurements. Within this thesis, the problems of the most common commercially available substrate, 4-methylumbelliferyl--D-glucuronic acid during QRTF assays were analyzed. With the gained insight into the synthesis and purification of -glucuronidase substrates a variety of different fluorogenic substrates were designed and successfully applied in QRTF enzyme assays. In these novel substrates, self immolative linkers were implemented to access new fluorophores and fluorescence resonance energy transfer (FRET) mechanisms. Furthermore, with the separated reaction and measurement (SRM) device a new approach for QRTF assays was designed. In SRM assays the substrate is immobilized on a solid phase, after the enzymatic reaction the fluorophore is released and can be measured. Due to the separation of the substrate from the measurement unit, the background fluorescence is considerably diminished resulting in an increased sensitivity of the enzyme assay. In summary, this work shows novel sensitive and fast strategies for the investigation of the bacterial load of biological systems.

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