Titelaufnahme

Titel
Proteomics characterisation of the secretome of mesenchymal stem cells / von Anna-Katharina Koch
VerfasserKoch, Anna-Katharina
Begutachter / BegutachterinMarchetti-Deschmann, Martina
Erschienen2015
Umfang[74] Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Techn. Univ., Dipl.-Arb., 2015
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
DokumenttypDiplomarbeit
Schlagwörter (DE)Massenspektrometrie / Elektrophorese / Quantifizierung / DIGE
Schlagwörter (EN)Mass Spectrometry / Electrophoresis / Quantification / DIGE
URNurn:nbn:at:at-ubtuw:1-85904 Persistent Identifier (URN)
Zugriffsbeschränkung
 Das Werk ist frei verfügbar
Dateien
Proteomics characterisation of the secretome of mesenchymal stem cells [5.21 mb]
Links
Nachweis
Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Eine Induktion wie beispielsweise Normoxie oder Hypoxie kann die Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen beeinflussen, wodurch es zu Veränderungen in ihrem Sekretom kommen kann. Im Allgemeinen werden Normoxie und Hypoxie als biotechnologische "Werkzeuge" angesehen, die die Zelldifferenzierung kontrollieren. Allerdings ist die Charakterisierung solcher Veränderungen des Sekretoms, aufgrund der Anwesenheit von hochabundanten Proteinen des umgebenden Mediums, sehr schwierig. Daher wurde der Fokus in der vorliegenden Arbeit auf die Entwicklung einer Proben-Vorfraktionierungsmethode gelegt, um mögliche Variationen im Sekretom zu detektieren. Für eine robuste Methodenevaluierung wurde als erster Schritt die Proteinfällung untersucht. Die Präzipitation, mit Trichloressigsäure und eisgekühltem Aceton (v:v/1:8), erzielte reproduzierbare Ergebnisse, welche durch SDS PAGE verifiziert wurden. Als zweiter Schritt wurde ein reproduzierbarer zwei dimensionaler Gel Elektrophorese (2D GE) Ansatz etabliert, um eine reproduzierbare Proteinseparation zu erzielen. Aufgrund der Kultivierung in humanserumhaltigem Medium, war der Hauptfokus dieser Arbeit die hochabundanten Serumproteine abzureichern, um niedermolekulare Sekretomproteine detektieren zu können. Dazu wurden zwei unterschiedliche Vorfraktionierungsmethoden, auf deren Effektivität, in der Entfernung dieser hochabundanten Serumproteine verglichen. Mit der ersten Methode wurden die 12 am häufigsten vorkommenden Serumproteine, mittels Antikörper basierten Affinitätssäulchen (Top 12 depletion spin columns), entfernt. Die zweite Methode basiert auf der Anreicherung von Sekretomproteinen, welche von spezifischen Liganden gebunden werden, die kovalent an Beads gebunden sind (Combinatorial peptide ligand library). Für die Detektion möglicher Unterschiede, aufgrund verschiedener Kultivierungsbedingungen (Normoxie und Hypoxie), wurde eine Differenz Gelelektrophorese (DIGE) durchgeführt. Die Verwendung von Antikörper basierten Affinitätssäulchen resultierte in einer effektiven Reduktion der hochabundanten Serumproteine, was sich in einer reduzierten Anzahl von Proteinbanden im eindimensionalen (1D), sowie in einer geringeren Anzahl von Proteinspots im zweidimensionalen Gel (2D) wiederspiegelt. Die Co-Abreicherung, von in geringen Mengen vorhandenen Sekretomproteinen, schien sehr wahrscheinlich, da potentielle Trägerproteine, wie das Serumalbumin nahezu komplett entfernt wurden. Die zweitgenannte Methode, war zwar in der Entfernung der Serumproteine weniger effizient, Serumalbumin war weiterhin vorhanden, jedoch weniger konzentriert. Wir nehmen daher an, dass die zuvor genannte Co-Abreicherung unter diesen Bedingungen reduziert wird, und eine vollständige Erfassung des Sekretom erreicht wird. Für weitere Versuche wurde der zweite Ansatz herangezogen, um die Reproduzierbarkeit und Robustheit der Probenvorbereitung für 2D GE und DIGE Analysen zu zeigen. Die DIGE Analyse zeigte für einige Proteine variable Spot Intensitäten, was auf einen unterschiedlichen Expressionsgrad von gewissen Proteinen hinweist.

Zusammenfassung (Englisch)

Depending on a distinct induction of mesenchymal stem cells, e.g. normoxie or hypoxie, protein expression levels can be influenced, potentially leading to a variation in their secretome. Normoxie and hypoxie are tools to control cell differentiation, tools of special interest in biotechnology. However, if cell differentiation is studied in a serum containing medium, the detection and characterization of changes in secretome expression levels is very difficult because of the presence of high-abundance proteins in the surrounding medium superimposing the rather low concentrated secretome. In the present study we are focussing on the development of a sample pre-fractionation method to characterize and detect changes in the secretome of mesenchymal stem cells cultivated in serum containing medium. As a first step protein precipitation from the serum was studied. Precipitation with trichloroacetic acid (TCA) solution and ice-cold acetone (v:v/1:8) turned out to give reproducible results which were checked by SDS-PAGE. In a second step two dimensional gel electrophoresis (2D GE) had to be established for a good and reproducible separation of the rather high number of proteins in the serum containing medium. As the focus of this study was the assessment of secretome changes, a dedicated sample preparation had to be established to have access to these rather low concentrated proteins. Therefore, high-abundance serum proteins from the medium had to be significantly removed. Two completely different depletion methods were compared with respect to the efficiency of high-abundance serum protein removal. The first method is based on a one-step removal of the twelve most abundant protein species using antibody-based affinity columns. The second approach is relying in the enrichment of the secretome on beads carrying specific, covalently bound ligands (combinatorial peptide library). Finally the secretome of mesenchymal stem cells after normoxic and hypoxic cultivation was studied in a difference gel electrophoresis (DIGE) approach. By using Top12 depletion spin columns, an efficient reduction of high-abundance proteins was observed, resulting in a reduced number of protein bands in 1D and a lower number of spots in a two dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D PAGE). However, co-depletion of low abundant proteins was considered to be very likely because potential carrier proteins e.g. serum albumin were almost completely removed. The combinatorial peptide library showed a lower efficiency for serum protein removal. Serum albumin was still observed, however less concentrated. We assumed that co-depletion was reduced under these conditions and a more complete coverage of the secretome was achieved. We evaluated the latter approach to show reproducibility and robustness of sample preparation for 2D GE and 2D DIGE analysis. DIGE analysis showed variable intensities for some protein spots, indicating different expression levels of certain proteins.