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Title
Entwicklung und Anwendung von schnellen, isothermalen Amplifikationstechniken zur Analyse von Nahrungsmitteln / Celine Zahradnik
AuthorZahradnik, Celine
CensorMach, Robert ; Brunner, Kurt
Published2014
Description83
Institutional NoteWien, Techn. Univ., Diss.
Annotation
Arbeit an der Bibliothek noch nicht eingelangt - Daten nicht geprueft
LanguageEnglish
Document typeDissertation (PhD)
Keywords (DE)isothermale PCR / qPCR / Pilze / Allergene / Lebens- und Futtermittel / DNA Diagnostik
Keywords (EN)Isothermal PCR / qPCR / fungi / allergenes / food and feed / DNA diagnostics
URNurn:nbn:at:at-ubtuw:1-71220 Persistent Identifier (URN)
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Entwicklung und Anwendung von schnellen, isothermalen Amplifikationstechniken zur Analyse von Nahrungsmitteln [11.47 mb]
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Abstract (German)

Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung DNA-basierter isothermaler Amplifikationstechniken für die rasche Analyse unerwünschter Bestandteile in Lebensmitteln in den Bereichen Allergen- und GVO-Nachweise sowie Lebensmittelauthentifizierung. Obwohl durchaus Testsysteme für diese Zielbereiche existieren, sind viele der dabei angewandten Methoden komplex in der Durchführung, zeitintensiv und lassen sich kaum in als vor-Ort-Analysen einsetzen. Kernthema dieser Studie ware die Entwicklung dreier isothermaler Amplifikations-Assays für die Analyten Sellerie, GVO-Mais und Pferdefleisch, um diese neuen Amplifikationstechniken in den Bereich Lebensmittelsicherheit zu transferien. Obwohl DNA-basierte Methoden für den Nachweis dieser Targets empfehlenswert sind, hat die konventionelle PCR mehrere Nachteile, die diese Methode ungeeignet für schnelle vor-Ort-Analysen machen. Die Anwendung isothermaler Amplifikationstechnologien kann viele dieser Nachteile eliminieren und ebnet den Weg für eine neue Generation DNA-basierter Test-Methoden. Seit 2005 wird die Etikettierung von Sellerie und Sellerieprodukten aufgrund des allergenen Potentials durch die Richtlinie 2003/89/EC der Europäischen Kommission vorgeschrieben. Im Zuge der Entwicklung von DNA-basierten und einfach durchzuführenden Test-Methoden, welche eine rasche Analyse erlauben, wurde ein Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay für den Nachweis von Sellerie (Apium graveolens) entwickelt. Dieser Test wurde auf seine Spezifität für Sellerie untersucht, da eine Vielzahl von eng verwandten Arten ebenso große Bedeutung in der Lebensmittelindustrie besitzt. Die Nachweisgrenze für mit Sellerie versetzten Proben lag bei 7.8 mg Selleriepulver pro Kilogramm. Eine Evaluierung verschiedener Amplifikations- und Detektionsplattformen konnte die zuverlässige Detektion, unabhängig von verwendeten Geräten (Thermocycler oder Heizblock) und Nachweismechanismen (real-time Fluoreszenzmessung, Agarosegelelektrophorese oder Nukleinsäure-Färbung), zeigen. Die Analyse zehn kommerzieller Lebensmittelprodukte mit möglichst komplexen Matrices ergab eine Falsch-Negativ-Rate von 0% für 24 Target-Kopien bzw. 0.08 ng Sellerie-DNA in drei ausgewählten Produkten und zeigt, daß LAMP das Potenzial als alternative Nachweis-Strategie für die Detektion von allergenem Sellerie besitzt. Die Effizienz des entwickelten LAMP-Assays ist wenigstens als gleichwertig anzusehen im Vergleich zu früher entwickelten PCR-Assays für Sellerie in Lebensmitteln. Diese Studie wurde im Journal Analytical & Bioanalytical Chemistry publiziert (Publikation #1). Im Jahre 2003 wurde von der Europäischen Kommission eine Grenze von 0.9 % für gentechnisch veränderte Organismen (GVOs) und daraus abgeleitete Produkte in Lebens- und Futtermitteln eingeführt. Für Produkte, die diesen Grenzgehalt überschreiten, ist die entsprechende Etikettierung verpflichtend. Im Zuge der Entwicklung von DNA-basierten und einfach durchzuführenden Testmethoden, welche eine rasche und unkomplizierte Analyse erlauben, wurden verschiedene Isothermale Amplifikationstechniken für den Nachweis des P35S-Promoters untersucht: Strand Displacement Amplification, Nicking-Enzyme Amplification Reaction, Rolling Circle Amplification, Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) und Helicase-dependent Amplification (HDA). Die entwickelten Assays wurden auf ihre Selektivität hinsichtlich der Unterscheidung zwischen gentechnisch verändertem und nicht verändertem Mais untersucht. Für diejenigen Techniken, die eine entsprechenden Diskriminierung zwischen GVO-Mais und Nicht-GVO-Mais erlauben, wurde eine Nachweisgrenze ermittelt. Zusätzlich wurde die Falsch-Negativ-Rate ermittelt, um eine Deklaration von GVO-Mais als nicht GVO-Mais auszuschließen. Ebenso wurde Tests durchgeführt um einen zuverlässigen Nachweis, unabhängig von verwendeten Instrumenten, zu gewährleisten. Die Analyse von drei verschiedenen GVO-Mais-Sorten zeigte, daß lediglich LAMP und HDA in der Lage waren, zwischen den gentechnisch veränderten Mais-Sorten MON810, NK603 und Bt11 und Nicht-GVO-Mais zu unterscheiden. Für die HDA konnte außerdem eine Nachweisgrenze von 0.5 % realisierte werden, sowie eine Falsch-Negativ-Rate von 5 % für alle drei Sorten 1%-GVO-Mais. Dies zeigt, daß die HDA als alternative Nachweis-Strategie für GVO-Mais eingesetzt werden kann. Alle Ergebnisse für LAMP und HDA wurden mit einem früher publizierten real-time PCR-Assay zum Nachweis des P35S-Promoters in gentechnisch verändertem Mais verglichen. Diese Studie erläutert die Entwicklung zwei neuer Screening-Assays für den P35S-Promoter in GVO-Mais mittels isothermaler Amplifikationstechniken. Diese Studie wurde im Journal Analytical & Bioanalytical Chemistry publiziert (Publikation #2). In der dritten Studie wird die Entwicklung einer simplen und schnellen Nachweis-Technik für Pferdefleisch in prozessierten Lebensmitteln beschrieben. Ziel-Molekül der spezifisch entwickelten LAMP-Primer ist das mitochondriale Genom der Spezies Pferd (Equus caballus). Für Rind-, Schweine- und Hühnerfleisch konnten keine Kreuzreaktionen beobachtet werden, eine zuverlässige Nachweisgrenze von 0.1 ng extrahierte Pferde-DNA wurde ermittelt. Die Analyse von Modell-Würsten mit definiertem Pferdefleischgehalt konnte zeigen, daß der entwickelte Assay Gehalte von 0.1 % Pferdefleisch, unabhängig von Kochzeiten, zuverlässig nachweisen kann. Zusätzlich wurden fünf verschiedene, kommerziell erhältliche Pferdefleischprodukte untersucht, um außerdem eine Unabhängigkeit von Lebensmittelmatrices zu zeigen. Alle Experimente wurden auf einem Heizblock durchgeführt, die Detektion erfolgte visuell mittels eines interkalierenden Farbstoffes. Die Ergebnisse wurden mittels real-time Fluoreszenzmessung mit einem zuvor publizierten PCR-Assay für den Nachweis von Pferdefleisch verglichen. Diese Methode stellt eine einfach und effiziente Alternative für den Nachweis von Pferdefleisch in der Zukunft dar. Diese Studie wurde im Journal Food Analytical Methods publiziert (Publikation #3). Die in dieser Arbeit entwickelten Methoden stellen eine neue und vielversprechende Alternative zu konventionellen Testsystemen für Lebensmittelprodukte dar, die bislang nur im Labor durchführbar und mit entsprechendem Zeit- und Personalaufwand verbunden sind. Für alle untersuchten Analyten (Sellerie, GVOs, Pferdefleisch) ist ein DNA-basiertes Testsystem notwendig, da ein spezifischer Nachweis ohne Co-Detektion andere Inhaltsstoffe nur über die entsprechende DNA-Sequenz möglich ist. Isothermale Amplifikationsmethoden bieten die Möglichkeit, diese Analyten ohne besonderen Geräteaufand in wesentlich kürzerer Zeit vor Ort nachzuweisen und werden in Zukunft dazu beitragen, umfangreiche Kontrollen mit einer großen Anzahl an Proben rasch und einfach durchzuführen.

Abstract (English)

The main objective of this thesis was the development of DNA-based isothermal amplification techniques for the rapid analysis of unwanted compounds in food products with focus on allergens, GMOs and animal species identification. Although tests for said analytes are available, many of these methods are laborious, time-consuming and difficult to transfer into a more field-applicable approach. Core of this thesis was the development of three isothermal amplification assays for the detection of the food allergen celery, transgenic maize and horse meat to show a methodical transfer of these techniques to matters of food safety. Although a DNA-based approach for the detection of these targets is recommended, conventional PCR has several drawbacks that make it unsuitable for the rapid on-site analysis of foods. The application of isothermal amplification techniques eliminates many of these drawbacks and smoothens the way for a new generation of DNA-based assays. Since 2005, celery and celery products have to be labeled according to Directive 2003/89/EC due to their allergenic potential. In order to provide a DNA-based, rapid and simple detection method, a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for the detection of celery (Apium graveolens) was developed. The assay was tested for specificity for celery since closely related species also hold food relevance. The limit of detection (LOD) for spiked food samples was found to be as low as 7.8 mg of dry celery powder per kilogram food product. An evaluation of different amplification and detection platforms was performed to show reliable detection independent from the instrument used for amplification (thermal cycler or heating block) and detection mechanisms (real-time fluorescence detection, agarose gel electrophoresis or nucleic acid staining). The analysis of 10 commercial food samples representing diverse and complex food matrices, and a false-negative rate of