Titelaufnahme

Titel
Development and validation of molecular assays for rapid detection of waterborne pathogens and indicator organisms / Eva Theres Gensberger
VerfasserGensberger, Eva Theres
Begutachter / BegutachterinSessitsch, Angela ; Steiner, Ingrid
Erschienen2014
Umfang133
HochschulschriftWien, Techn. Univ., Diss.
Anmerkung
Arbeit an der Bibliothek noch nicht eingelangt - Daten nicht geprueft
SpracheEnglisch
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Trinkwasser / Analytik / Mikrobiologie
Schlagwörter (EN)Trinkwasser / Analytik / Mikrobiologie
URNurn:nbn:at:at-ubtuw:1-69187 Persistent Identifier (URN)
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Development and validation of molecular assays for rapid detection of waterborne pathogens and indicator organisms [2.5 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Alternative DNA-basierter molekulare Methoden ermöglichen eine schnellere und spezifischere Analyse in der Wasserqualitätsbewertung mit erhöhtem Probendurchsatz im Vergleich zu zeitintensiven Kultivierungsverfahren. Die Verwendung der real-time (RT-PCR) in Kombination mit der Behandlung von Propidium Monoazide (PMA), zur Differenzierung von DNA aus lebenden und toten Bakterienzellen, wurde für alle in der Trinkwasserverordnung (TVO, BGBl. II Nr. 304/2001) definierten mikrobiellen Parameter (E .coli, coliforme, Enterococcus spp., P. aeruginosa und Keimzahlbestimmung (KBE)) etabliert. In der Entwicklungsphase wurde das Potential der Lebend/Tot Differenzierung, durch Verwendung von 10 M PMA anhand der signifikanten (3log10) oder kompletten Unterdrückung von DNA aus hitze-getöteten E. coli und P. aeruginosa Zellen in einer Probe mit abundanter Wassermikroflora demonstriert. Das Anwendungspotenzial der PMA-RT-PCR wurde in einer Evaluierung zu Referenzverfahren und RT-PCR ohne PMA mit einer Vielzahl an Trinkwasserproben und Prozesswasserproben getestet und resultierte in einer hohen Spezifität für die Detektion von E. coli, Enterococcus spp., P. aeruginosa, jedoch zeigte sich die Limitation der Sensitivität und der Detektion von coliformen Keimen und der KBE. Zudem wurde die KBE und deren Kultivierungsparameter, definiert in EN ISO 6222:1999 und EPA, auf die Bakterienökologie durch 16S rRNA Sequenzanalyse betrachtet. Eine signifikante Auswirkung auf das präsente Bakterienspektrum konnte durch die Kultivierungsparameter beobachtet werden, wobei signifikante Effekte durch den Parameter der Temperatur (p< 0.01) statistisch bewertet werden konnten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die KBE Bestimmung bezugnehmend auf deren Aussage des Qualitätszustands einer einzeln analysierten Wasserprobe überdacht werden sollte. Kultivierungsmethoden als standardisierte Verfahren sind derzeit in der Wasserqualitätsbewertung noch nicht durch molekulare Methoden zu ersetzen. Gelingt es die Sensitivität zu verbessern, birgt sich eine gute Verwertungschance in der PMA-RT-PCR Methode durch die hohe Spezifität und die Gewährleistung der schnelleren Aussage um ein rasches Eingreifen im Kontaminationsfall zu ermöglichen.

Zusammenfassung (Englisch)

Alternative DNA-based molecular assay enable a rapid, specific and high-throughput analysis in water quality assessment in comparison to laborious cultivation-based techniques. Real-time (RT)-PCR in combination with the treatment of propidium monoazide (PMA) was developed for the detection of microbial parameters specified by the Austrian Drinking Water Regulation (BGBl. II Nr. 304/2001), i.e. E. coli, coliforms, Enterococcus spp., P. aeruginosa and heterotrophic plate count (HPC). The PMA treatment was included into RT-PCR analysis to allow for discrimination between DNA targets from living and dead organism, which is prerequisite for quality assessment, as only viable cells are determined by standardized techniques and may pose a health risks. In the proof of principle study the live/dead discrimination potential of PMA-RT-PCR was demonstrated. Treatment with 10 M PMA resulted in the significant (3 log10) or complete suppression of false positive signals arising from heat-killed E. coli and P. aeruginosa from samples with an abundant background water microflora. The application potential of PMA-RT-PCR in comparison to conventional reference methods and RT-PCR without PMA was approved in an extended evaluation with a set of drinking and process water samples. Best performance due to high specificity of PMA-RT-PCR was achieved for E. coli, Enterococcus spp. and P. aeruginosa. Challenges remained in the sensitivity and the establishment of molecular assays for the detection of coliforms and total bacterial count. Further the HPC used as quality parameter was assessed in detail for the composition of culturable HPC community under different cultivation conditions, outlined in EN ISO 6222:1999 and EPA, by 16S rRNA gene sequence analysis. HPC communities revealed significant differences in microbial composition accordingly to cultivation parameter applied, with significant effects of temperature (p< 0.01). Summarizing the findings, the significance of HPC in water quality assessment should be reconsidered for isolated assessment of a single water sample. At present cultivation-based methods for water quality assessment cannot be replaced by molecular assays, but given the careful optimization for improving sensitivity and refinements in PMA-RT-PCR, molecular assays represent a promising and valuable detection method due to the high specificity and rapid analysis, to allow immediate actions in case of a determined contamination.