Titelaufnahme

Titel
Characterization of extracellular carbohydrate binding proteins unique in fungi / Simone Zach
VerfasserZach, Simone
Begutachter / BegutachterinKubicek, Christian ; Glieder, Anton ; Seidl-Seiboth, Verena
Erschienen2012
UmfangVII, 144 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Techn. Univ., Diss., 2012
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Trichoderma atrovirde / Mykoparasitismus / Kohlenhydrat bindende Proteine / Cerato-Platanin Proteine / LysM Proteine
Schlagwörter (EN)Trichoderma atrovirde / mycoparasitismus / carbohydrate binding proteins / cerato-platanin proteins / LysM proteins
Schlagwörter (GND)Trichoderma atroviride / Chitin / Chemische Bindung / Proteine / Lysin
URNurn:nbn:at:at-ubtuw:1-58238 Persistent Identifier (URN)
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Characterization of extracellular carbohydrate binding proteins unique in fungi [31.47 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Der filamentöse Bodenpilz Trichoderma atroviride wird in der Landwirtschaft als biologisches Pflanzenschutzmittel gegen pflanzenpathogene Pilze verwendet.

Mykoparasitismus- die Attacke und das Töten von anderen Pilzen- ist einer der Mechanismen, der für die schützenden Eigenschaften von T.

atroviride gegenüber Pflanzen verantwortlich ist. Dabei profitiert T.

atroviride von einer mächtigen enzymatischen Maschinerie bestehend aus Zellwand abbauenden Enzymen, einschließlich Chitinasen und Glukanasen, die in mykoparasitische Aktivitäten als auch in Prozesse zur Neugestaltung der Zellwand involviert sind.

Die Chitinasen von Pilzen können in drei Untergruppen (A, B und C) eingeteilt werden. Chitinasen der Untergruppe C besitzen zwei verschiedene Typen von Kohlehydrat-Bindungsdomänen (carbohydrate binding modules; CBMs)- CBM18 und CBM50 (LysM Motive)- die nicht in vielen anderen Enzymen von Pilzen vorkommen.

In dieser Arbeit lag der Fokus auf TAL6, einem Protein das aus 6 LysM Motiven besteht, jedoch keine katalytische Proteindomäne besitzt Um die Funktionen dieses Proteins zu untersuchen wurden eine vollständige Version des Proteins bestehend aus allen 6 LysM Motiven (TAL66) als auch eine verkürzte Version von TAL6 (TAL64), nur bestehend aus den vier stark konservierten LysM Motiven der C-terminalen Region von TAL6 charakterisiert. Untersuchungen der Fähigkeit dieser Proteine an Kohlenhydrate zu binden wurden sowohl mit verschiedenen Kohlenhydrat-Polymeren, als auch mit chitin-hältigen Zellwänden von Trichoderma-Arten und der pflanzenpathogenen Rhizoctonia solani und Botrytis cinerea durchgeführt. Es zeigte sich eine Affinität der Proteine für hochprozessierte Formen von Chitin, jedoch konnte keine Bindung an die Zellwände der Pflanzenpathogenen festgestellt werden.

Weiters wurde der Einfluß von TAL66 and TAL64 auf die Sporenkeimung von T. atroviride und nahe verwandten Gattungen als auch von Aspergillus niger und Neurospora crassa untersucht. Dabei wurde ein stark inhibierender Effekt von TAL66 auf die Sporenkeimung von Trichoderma-Arten beobachtet. Dieser Effekt konnte jedoch nicht bei TAL64 beobachtet werden, was darauf hinweist, dass die zwei N-terminalen LysM Motive von TAL66, die mit bisher bekannten LysM Motiven eher weitläufig verwandt sind, essentiell für die Funktion von TAL6 sind. Die beobachtete Inhibierung der Keimung war auf die Gattung Trichoderma begrenzt. Diese Ergebnisse zeigten klar, dass TAL6 eine biologische Funktion besitzt, die nicht mit dem Mykoparasitismus verbunden ist, sondern eher auf einen selbst- regulierenden Effekt während der Sporenkeimung hinweist.

Kürzlich durchgeführte Analysen des Genoms von T.atroviride zeigten, dass dieser Pilz nicht nur Chitin- abbauende Enzyme besitzt, sondern auch ein Arsenal an verschiedenen Cystein-reichen Proteinen, die möglicherweise an der Protektion der eigenen Pilz-Zellwand gegenüber hydrolytischen Enzymen beteiligt sind. Zusätzlich wurde gezeigt, dass einige Trichoderma spp. fähig sind Abwehrreaktionen in der Pflanze zu induzieren und das Pflanzenwachstum zu fördern. Eine Vielzahl an verschiedenen Proteinen die diese Effekte verursachen, wurden bereits für solche Systeme beschrieben, dazu gehören Cerato-Platanin Proteine (CPPs) und Hydrophobine, aber auch Enzyme wie z.B. Xylanasen und Polygalakturonasen. Das EPL1 Protein von T. atroviride gehört zu der Cerato-Platanin Proteinfamilie, deren Mitglieder viele verschiedene Funktionen wie Zellwandummantelung und Zellwandprotektion aufweisen und von denen gezeigt wurde, dass sie als Auslöser für Abwehrreaktionen in Pflanzen agieren. Untersuchungen der Fähigkeit von EPL1 an Kohlenhydrate zu binden zeigten, dass EPL1 an flockiges Chitin in unterschiedlicher Größe und an kolloidales Chitin binden kann, jedoch zeigte sich keine Bindeaffinität für Chitin Beads oder für die Zellwände von T.

atroviride. In dieser Arbeit wurden erste Schritte zur Aufklärung der Funktion verschiedener Chitin- bindender Proteine gemacht. Darüber hinaus wird ein besseres Verständnis der Interaktionen und Mechanismen während des Wachstums und der Entwicklung der Spezies Trichoderma als auch deren Interaktion mit anderen Organismen hilfreich für die Entwicklung verbesserter Rezepturen von Pflanzenschutzmittel sein. Die gewonnenen Erkenntnisse sind wichtig in Bezug auf den existierenden Bedarf an ökologischeren Lösungen im Pflanzenschutz um einen umweltfreundlicheren Nutzen unserer natürlichen Ressourcen in Zukunft zu gewährleisten.

Zusammenfassung (Englisch)

The filamentous soil fungus Trichoderma atroviride is applied in agriculture as a biocontrol agent (biological pesticide) against plant pathogenic fungi. Mycoparasitism - the attack and killing of other fungi - is one of the mechanisms that are responsible for the plant protection properties of T. atroviride. Thereby, T. atroviride benefits from a potent enzymatic machinery of cell wall degrading enzymes including chitinases and glucanases, which are involved in the events during mycoparasitism as well as in cell wall remodeling processes. Fungal chitinases can be divided into three different subgroups, based on differences in their amino-acid sequences and structural compositions.

Chitinases of subgroup C have two different types of carbohydrate binding modules (CMBs) - CBM18 and CBM50 (LysM motifs) - that are not found in many other fungal enzymes. This thesis was focused on TAL6, a protein that contains 6 LysM motifs but no catalytic module. In order to be able to investigate the functions of this protein a full-length version of TAL6 containing all six LysM motifs (TAL66) and a truncated version of TAL6 (TAL64) that consists only of the four strongly conserved LysM motifs from the C-terminal region of TAL6 were characterized. Carbohydrate- binding assays using different carbon sources as well as cell walls of plant pathogenic Rhizoctonia solani and Botrytis cinerea were conducted and revealed an affinity of TAL6 for chitin beads and colloidal chitin, but no binding behavior towards the cell walls of the plant pathogens could be observed. Further the effects of TAL66 and TAL64 on spore germination of T.

atroviride and close relatives, as well as of Aspergillus niger and Neurospora crassa were examined. A strong inhibitory effect for TAL66 but not for TAL64 on Trichoderma spp. but not on other tested fungi was observed. This suggests that the two N-terminal LysM motifs of TAL66, which are rather distantly related to so far characterized LysMs, are essential for the function of TAL6. These results showed clearly that TAL6 has a biological function which is not connected to mycoparasitism but is rather directed towards a self-regulatory effect during spore germination.

Recent analysis of the genome of T. atroviride showed that this fungus has not only chitin degrading enzymes but also an arsenal of different cysteine-rich proteins that possibly participate in protection of the own fungal cell wall against hydrolytic enzymes. In addition it was shown that several Trichoderma spp. are able to induce plant defense responses and enhance plant growth. A number of different elicitor proteins have already been described for these systems, ranging from cerato-platanin proteins (CPPs) and hydrophobins to xylanases and polygalacturonases.

The protein EPL1 from T. atroviride belongs to the cerato-platanin protein family, of which members display various different functions like cell wall coating and protection and have been demonstrated to act as elicitors of plant defense responses. Carbohydrate- binding analysis revealed that EPL1 is able to bind to flaked chitin, in different sizes and to colloidal chitin but exhibited no binding affinity to chitin beads or to cell walls of T. atroviride. In this thesis first steps were made to elucidate the function of different types of chitin binding proteins. Further, a better understanding of the interactions and mechanisms of the growth and development of Trichoderma spp. and its interaction with other organisms will aid in developing improved formulations for biocontrol agents. This will be important towards the existing demand for more ecological solutions with respect to crop protection to achieve a more environmentally friendly use of our natural resources in the future.