Titelaufnahme

Titel
Application of microfluidic devices for time resolved FTIR spectroscopy / by Christoph Karl Wagner
VerfasserWagner, Christoph
Begutachter / BegutachterinLendl, Bernhard ; Baurecht, Dieter
Erschienen2012
UmfangXIV, 223, 4 S. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Techn. Univ., Diss., 2012
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Zeitaufgelöste FTIR-Spektroskopie / Step-Scan Spektroskopie / Mikrofluidische Mischer / MOEMS Spektrometer / Formaldehyd Sulfit Reaktion / H/D Austausch / Protein Faltung / Ubiquitin / Myoglobin / Cytochrom-c-Oxidase
Schlagwörter (EN)Time resolved FTIR spectroscopy / Step Scan spectroscopy / Micro fluidic mixers / MOEMS spectrometers / Formaldehyde sulfite clock reaction / H/D exchange / Protein folding / Ubiquitin / Myoglobin / Cytochrome c oxidase
Schlagwörter (GND)Wässrige Lösung / Chemische Reaktion / FT-IR-Spektroskopie / Zeitauflösung / Mikrofluidik / Mischen
URNurn:nbn:at:at-ubtuw:1-50990 Persistent Identifier (URN)
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Application of microfluidic devices for time resolved FTIR spectroscopy [26.23 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Im Rahmen dieser Arbeit wurden mikrofluidische Mischer, welche im kontinuierlichen Durchfluss betrieben wurden, zur zeitaufgelösten Untersuchung von chemischen Reaktionen in wässrigen Lösungen mit Hilfe der FTIR-Spektroskopie genutzt. Der Vorteil dieser Messtechnik liegt darin, dass sich alle chemischen Reaktionen untersuchen lassen, die durch das Mischen von zwei Reagenzien gestartet werden können. Hierbei dient der Mischkanal des mikrofluidischen Mischers auch gleichzeitig als Messkanal für die Infrarotmessungen. Die Messungen werden entlang dieses Kanals an definierten Positionen durchgeführt: Je weiter der Messfleck (100 100 mym2) vom Anfang in Richtung Ende des Kanals verschoben wird, desto weiter ist die Reaktionszeit der ablaufenden Reaktion fortgeschritten. Die erreichbare zeitliche Auflösung des Experiments hängt von zwei Faktoren ab: Erstens von der Fließgeschwindigkeit im Kanal und zweitens vom räumlichen Abstand zwischen den aufeinanderfolgenden Messpunkten. Unter Verwendung eines FTIR-Mikroskops lassen sich bei hohen Flussraten Zeitauflösungen im Submillisekunden-Bereich erreichen. Verwendet man hingegen langsame Flussraten, kann die messbare Reaktionszeit auf bis zu 1000 ms ausgedehnt werden.

Zu Beginn dieser Arbeit wurde die Mischzeit des verwendeten Mikromischers mit Hilfe einer schnellen Reaktion evaluiert und belief sich auf rund 5 ms. Zusätzlich wurde die gleichmäßige räumliche Verteilung der Flüssigkeiten im Kanal evaluiert.

Im Anschluss wurde der H/D Austausch an Zuckern, die komplexe Reaktion von Formaldehyd mit Sulfit und die Faltung des Proteins Ubiquitin, welches durch die Mischung mit angesäuertem Methanol vom natürlichen in den "A" Zustand umgewandelt wird, vermessen. Für die Reinigung des Mischers nach einem Experiment wurde ein automatisiertes Fließsystem verwendet, welches durch ein neu entwickeltes LabVIEW Programm, namens ATLAS, gesteuert wurde.

Zusätzlich dazu wurde die Mikromischer-Technologie mit der Step-Scan Messtechnik kombiniert. Hierfür wurde eine externe Fokussiereinrichtung verwendet um das IR Licht des Spektrometers auf den Mischer zu fokussieren (Durchmesser des Messflecks rund 1 mm). Gleichzeitig wurde ein Laser, welcher zur Anregung der Reaktion im Mischer benötigt wird, mittels eines dichroitischen Spiegels eingekoppelt und auf den Messfleck fokussiert. Wird die Probe im Messfleck zwischen zwei Anregungen durch den Laser durch einen kontinuierlichen Fluss im Kanal komplett ausgetauscht, so können auch nicht-zyklische Reaktion mittels der Step-Scan Technik vermessen werden.

Mittels dieses Messaufbaus wurde die Rückbindungskinetik von Kohlenstoffmonoxid an Myoglobin (Mb), nach der Photodissoziation des Mb-CO Komplexes, evaluiert und ein bi-exponentielles Verhalten sowohl für die Rückbindung als auch für die Veränderungen an der Sekundärstruktur des Proteins ermittelt. Die Vermessung des Photozyklus der Cytochrom-c-Oxidase scheiterte allerdings, da die maximal mögliche Konzentration des Proteins in Lösung zu niedrig war um bei einer Absorptionsstrecke von 10 mym des Mischers ein messbares Signal des Proteins im Bereich der Amid Banden zu erhalten.

Als dritter Ansatz für die zeitaufgelöste Messung von Reaktionen wurden MOEMS Spektrometer evaluiert, welche eine sehr hohe Messgeschwindigkeit pro Spektrum ermöglichen. Durch den frühen Entwicklungsstand der zur Verfügung stehenden Prototypen konnte allerdings keine ausreichendes Signal/Rauschverhältnis ohne starke Mittelwertbildung erreicht werden, wodurch der Geschwindigkeitsvorteil gegenüber klassischen FTIR Spektrometern nicht genutzt werden konnte.

Zusammenfassung (Englisch)

Within this thesis, micro fluidic mixers, operated in continuous flow mode, were used for time resolved FTIR studies of chemical reactions in aqueous solution. Any chemical reaction, that can be started upon mixing two reagents, can be examined with this technique.

The mixing channel also serves as the observation window for the IR measurements. The actual measurements take place at well defined spots along this channel, corresponding to specific reaction times: moving the measurement spot (100 100 mym2) towards the entry yields shorter reaction times, moving it towards the channel's end gives longer reaction times. The temporal resolution of the experiment depends on the flow rate inside the mixing channel and the spacing between subsequent measurement points. Fast flow rates, limited by the back pressure of the mixer leading to leakages, allow time resolutions in the sub-millisecond time range using a standard FTIR microscope, whereas slow flow rates allow the measurement of reaction times up to 1000 ms.

Evaluating the mixer using a fast chemical reaction resulted in mixing times of approximately 5 ms and a homogeneous distribution of the liquids across the width of the mixing channel.

The mixer was then used for the measurement of the H/D exchange on carbohydrates, the complex formaldehyde sulfite clock reaction, and the folding of the protein ubiquitin from its native to the "A" state, induced by mixing it with an acidified methanol solution. For cleaning the mixer a software tool, called ATLAS, was developed in LabVIEW, which was used to automatize the necessary cleaning steps performed by a dedicated flow system.

Additionally, the micro mixer technology was combined with the step scan measurement technique using a beam condenser focusing the IR beam of an FTIR spectrometer down to a spot size of 1 mm diameter and through the mixer. The laser light, initiating the chemical reaction inside the mixing channel, was coupled into the focusing unit using a dichroic mirror. By continuously flowing sample through the measurement spot only fresh sample was excited for each measurement cycle, allowing the measurement of non- cyclic reactions. The rebinding kinetics of carbon monoxide to myoglobin, after photo dissociation of the carbonmonoxymyoglobin complex, was successfully investigated, showing bi-exponential reaction kinetics for the rebinding of the carbon monoxide and the relaxation of the induced changes in the protein's secondary structure. Measurements of the photo cycle of cytochrome c oxidase, however, failed due to physical limitations, such as the maximum possible concentration of cytochrome c oxidase and the path length of 10 mym needed to be able to measure the Amide I band of proteins in aqueous solution.

As a third approach to time resolved measurements, fast scanning MOEMS spectrometers were evaluated. Poor signal to noise ratios, due to the early stage of the used prototypes, forced the use of intensive signal averaging, which nullified the advantage of faster scan rates, compared to standard FTIR spectrometers.