Titelaufnahme

Titel
Development of a model system for the study of spontaneous mutagenesis in glucose-limited stationary yeast cells / Petra Dorninger
VerfasserDorninger, Petra
Begutachter / BegutachterinKubicek, Christian ; Heidenreich, Erich
Erschienen2011
UmfangIII, 144 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Techn. Univ., Diss., 2011
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Saccharomyces cerevisiae /adaptive Mutation / replikationsunabhängige Reversionen / stationäre Phase / Mutationsfrequenz / Kohlenhydrathungerung / FBP1
Schlagwörter (EN)Saccharomyces cerevisiae /adaptive mutation / replication-independent reversions / stationary phase / mutation frequency / carbohydrate starvation / FBP1
Schlagwörter (GND)Saccharomyces cerevisiae / Mutagenese / Mutation / Anpassung / Kohlenhydrate / Reduktion
URNurn:nbn:at:at-ubtuw:1-44311 Persistent Identifier (URN)
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Development of a model system for the study of spontaneous mutagenesis in glucose-limited stationary yeast cells [2.27 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Das Auftreten spontaner Mutationen kann zur Entstehung von Krebs beitragen, besonders wenn eine Zelle einer definierten Anzahl an genetischen Veränderungen ausgesetzt ist. Dies wiederum kann in den verschiedenen Krebsarten unterschiedlich sein. Die ermittelten Mutationsraten in proliferierenden Zellen sind jedoch nicht ausreichend hoch, um die häufigen multiplen Mutationen zu erklären. Aus diesem Grund nimmt man an, dass eine bedeutende Anzahl an Mutationen aus sich nicht teilenden Zellen entsteht. Adaptive Mutationen im Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae sind besonders gut geeignet, um spontane Mutagenese in ruhenden Zellen zu untersuchen. Aminosäurehungerung findet häufig eine Anwendung, um einen Zellzyklusarrest herbeizuführen. Besonders das lys2[Delta]Bgl System ist gut untersucht, indem Hefezellen für die essentielle Aminosäure Lysin gehungert werden. Diese Art der Hungerung birgt jedoch einige Nachteile in Betracht auf Stringenz des Zellzyklusarrests, der Anwesenheit von Glukose im Versuchsaufbau sowie das Nachahmen von natürlichen Gegebenheiten. Darum wurde in dieser Studie den beschriebenen Grenzen entgegengewirkt, indem die Aminosäurehungerung durch eine Kohlenhydrathungerung ersetzt wurde. Die beiden Zielgene FBP1, kodierend für Fruktose-1,6-bisphosphatase, und PCK1, kodierend für Phosphoenolpyruvat Carboxykinase, sind an der Glukoneogenese beteiligt und wurden disruptiert, um den Syntheseweg zu blockieren. Die Studie zeigt, dass das Unterbinden der Glukoneogenese auf nicht zuckerhaltigen Kohlenstoffquellen zu einem strikten Zellzyklusarrest ohne Restwachstum führt - und zwar von Beginn der Selektion an. Drei alternative Nährstoffe (Laktat, Pyruvat und Glyzerin) wurden für die Kohlenhydrathungerung getestet, wobei sich Laktat als die geeignetste Quelle herausstellte. In weiterer Folge wurde ein Hefestamm mit einer revertierbaren Frameshift-Mutation im FBP1-Gen konstruiert, um adaptive Mutationsversuche durchzuführen. Revertanten konnten mit dem neuen fbp1FS-128 System über einen Zeitraum von 22 Tagen ohne Artefakte detektiert werden. Das System konnte somit erfolgreich etabliert werden und wurde weiters für die Untersuchung einer rad27[Delta] Reparaturmutante herangezogen, was bisher mit Lysinhungerung nicht möglich war. Des Weiteren wurde ein Stamm mit einer Fusion des humanen Tumorsuppressorgens TP53 und FBP1 konstruiert, um die Mutationsfrequenz zu erhöhen.

Zusammenfassung (Englisch)

The occurrence of spontaneous mutations can lead to cancer especially if a cell undergoes a certain amount of genetic changes, which differs from type to type of cancers. However, mutation rates determined in proliferating cells are not sufficient to explain the observed frequencies of multiple mutations. Consequently, it is assumed that a nameable fraction of mutations also arises from non-proliferating cells.

Adaptive mutations in the model organism Saccharomyces cerevisiae are particularly suitable to study spontaneous mutagenesis in quiescent cells. Common systems use amino acid starvation to provoke cell cycle arrest. In particular the lys2[Delta]Bgl system is well-studied, where yeast cells are starved for the essential amino acid lysine. However, some disadvantages arise from this type of starvation, with regard to stringency of cell cycle arrest, mimicking of natural circumstances and presence of glucose in the experimental setup. Therefore, in this study those limits were antagonized by replacing amino acid starvation with starvation for carbohydrates. Two target genes, FBP1 encoding the enzyme fructose-1,6-bisphosphatase and PCK1 encoding phosphoenolpyruvate carboxykinase, involved in gluconeogenesis were impaired to block the pathway. The study showed that a block in gluconeogenesis leads to a strict cell cycle arrest without residual growth from the beginning of selection on non-sugar carbon sources. Three alternative nutrients (lactate, pyruvate and glycerol) were tested in carbohydrate starvation, revealing lactate to be the most suitable one. Furthermore, a frameshift strain with a revertible mutation in the FBP1 gene was constructed to perform adaptive mutation assays. Revertant colonies could be detected with the new fbp1FS-128 system over a time course of 22 days without artifacts. The system was established successfully and was also used to study rad27[Delta] repair gene mutant, which was not feasible with previously used lysine starvation. Moreover, a fusion of the tumor suppressor gene TP53 and FBP1 was constructed to increase mutation frequency.