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Title
From chip surface to signal amplification : protein microarrays for disease biomarker detection / von Patrick Domnanich
AuthorDomnanich, Patrick
CensorHaberhauer, Georg ; Gruber, Heinrich
Published2010
DescriptionVI, 119 Bl. : Ill., graph. Darst.
Institutional NoteWien, Techn. Univ., Diss., 2010
Annotation
Zsfassung in dt. Sprache
LanguageEnglish
Bibl. ReferenceOeBB
Document typeDissertation (PhD)
Keywords (DE)Protein Microarrays / his-Tag vermittelte orientierte Immobilisierung / Metallaffinitäts-Slides / Melanoma Biomarker / Polyelectrolyte Multilayer / Xanthan / Chitosan / Aptamer Chip
Keywords (EN)protein microarrays / his-tag mediated oriented immobilisation / metal affinity slides / nickel metal enhanced protein chip / melanoma biomarkers / polyelectrolyte multilayers / xanthan / chitosan / aptamer chip
Keywords (GND)Melanom / Serodiagnostik / Biomarker / Proteine / Microarray
URNurn:nbn:at:at-ubtuw:1-41687 Persistent Identifier (URN)
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From chip surface to signal amplification [3.84 mb]
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Abstract (German)

Protein Microarrays sind eine zukunftsträchtige Technologie mit zahlreichen Anwendungen in der klinischen Forschung und Diagnostik. Sie erlauben die gleichzeitige Analyse ganzer Sets von Biomarkern, die Rückschlüsse auf Krankheitsstadium und Verlauf zulassen. Dies ermöglicht einen weiteren Schritt in Richtung personalisierter Medizin, in der auf den Patienten abgestimmte, verträglichere Therapien Anwendung finden.

Das Melanom, eine besonders aggressive Form des Hautkrebses, zeichnet sich durch einen auffallend unberechenbaren klinischen Verlauf aus, der durch die derzeitigen Bewertungskriterien nur ungenügend erfasst wird.

Um die Prognosestellung zu erleichtern wurde in dieser Arbeit ein Protein Microarray zur simultanen und parallelen Analyse von fünf Melanom-Markern in Patientenblut entwickelt. Der Chip quantifiziert sowohl die spezifischen Prognose- und Staging-Faktoren S100B und Vascular Endothelial Growth Factor A (VEGF-A), als auch die krankheitsrelevanten Entzündungsmediatoren und Immunfaktoren C-reaktives Protein (CRP), Interleukin 6 (IL6) und Interleukin 10 (IL10). Die einzelnen Tests sind als Sandwich Immunoassays implementiert und werden mittels Fluoreszenzmessung ausgelesen. Die Optimierung von Druckpuffer, Antikörperkonzentration, Assaypuffer und Inkubationszeit führte zu einer hohen Reproduzierbarkeit (Variabilitätskoeffizient < 20%) und niedrigen Cross-Reaktivität (< 0,5% mit anti IL10). Des Weiteren wurden Testsensitivitäten erreicht, die in der Größenordnung kommerzieller ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) Einzeltests liegen. Während Interleukine in Konzentrationen von pg/mL detektiert werden müssen, liegen CRP Serum Konzentrationen normalerweise unter 3 mg/L und können im Fall einer Entzündung auf das Tausendfache ansteigen. Der CRP Antikörper Sandwich-Test weist jedoch nur einen Arbeitsbereich von 0.4 g/L - 0.2 mg/L CRP auf. Um die parallele Messung von CRP zu ermöglichen, wurden RNA Aptamere als alternative Erkennungsmoleküle untersucht. Tatsächlich zeigten Aptamer-Antikörper Sandwichtests breitere Arbeitsbereiche (10 g/L - 100 mg/L) und eine bessere Erfassung physiologischer CRP Konzentrationen.

Zur Sensitivitätssteigerung in Bezug auf niedrig konzentrierte Analyten, die nur schwache Fluoreszenzsignale liefern, wurde ein reflektierender Goldchip entwickelt, der mit Polyelektrolytmultilayern aus Xanthan und Chitosan beschichtet war. Auf diesen Signalverstärkungssubstraten waren die gemessenen Fluoreszenzintensitäten bis zu 50-mal so hoch wie auf Glaschips. In Bezug auf kommerzielle Chips wurde das Signal-Rausch-Verhältnis um bis zu Faktor 11 verbessert. Auch die Sensitivität stieg bis zu 38-fach an. Schließlich werden in dieser Arbeit Metall-Affinitäts-Slides präsentiert, die auf Derivaten von Aminosäuren basieren. Diese Substrate ermöglichen die Immobilisierung von poly-Histidin-markierten Proteinen mittels Nickel-Chelat-Komplexbildung und erleichtern so den Aufbau von Assays mit gleichmäßig orientierten Proteinen. Die Slides wurden mit Hilfe der Photoelektronenspektroskopie charakterisiert und wiesen Selektivitäten >95% für hexa-Histidin-markierte Proteine auf. Außerdem waren die Signalstärken bis zu sechsmal so hoch wie auf kommerziellen Substraten.

Abstract (English)

Protein microarrays are an emerging technology in clinical diagnostics. They permit the analysis of an entire set of biomarkers reflecting disease stage and likelihood of progression. Thus they could give raise to new, less toxic therapies on an individual patient's basis.

Melanoma, a form of skin cancer, features a highly variable clinical course that is not predictable by current staging criteria. To facilitate establishment of a prognosis a protein microarray for the simultaneous and highly parallel analysis of five melanoma biomarkers in patients' blood serum was developed. The chip quantifies specific prognostic and staging factors S100B and Vascular Endothelial Growth Factor A (VEGF-A) as well as disease-related inflammatory and immunomodulatory parameters - C-reactive Protein (CRP), interleukins IL6 and IL10. Individual tests are implemented as sandwich immunoassays with streptavidin-biotin chemistry and fluorescence detection. Optimization of parameters such as print buffer composition, antibody concentrations, assay binding buffer and incubation time led to high reproducibility (coefficient of variation < 20%), weak cross-reactivity (<0.5% with anti-IL-10) and excellent sensitivities that are perfectly comparable to classical single-analyte enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) tests.

While interleukins have to be detected at the pg/mL scale, CRP serum concentrations are normally below 3 mg/L and rise by a factor of 1000 in response to an inflammatory stimulus. The CRP antibody sandwich assay features a working range of 0.4 g/L - 0.2 mg/L CRP. To render possible the parallel analyte determination, in this thesis RNA aptamers were investigated as alternative binding elements. In fact aptamer-antibody sandwiches yielded broader working ranges (10 g/L - 100 mg/L) and showed improved coverage of elevated physiological CRP concentrations. To furthermore enhance the sensitivity for low abundant target proteins which only produce low fluorescence signals strengths, a reflective gold chip coated with xanthan chitosan polyelectrolyte multilayers is introduced. On this amplification substrate fluorescence signals are up to 50 times higher than on glass slides and in comparison to commercial substrates the signal to noise ratio is enhanced by up to factor 11.

Also sensitivity increases up to 38 fold.

Finally this thesis reports on metal affinity slides based on amino acid derived ligands. These substrates enable the immobilisation of poly-histidine-tagged proteins via nickel-chelate complexes and thus facilitate the set-up of assays with uniformly oriented probe molecules.

The slides are characterized by X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and show a selectivity >95% for tagged proteins in functional tests.

Signal strengths are up to six times higher than on commercial products.