Titelaufnahme

Titel
Quality by design for process understanding- multivariate studies on a recombinant E. coli expression system / Patrick Sagmeister
VerfasserSagmeister, Patrick
Begutachter / BegutachterinHerwig, Christoph ; Wechselberger, Patrick
Erschienen2011
UmfangIII, 108 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Techn. Univ., Dipl.-Arb., 2011
SpracheEnglisch
DokumenttypDiplomarbeit
Schlagwörter (DE)Quality by Design / E. coli / Alkalische Phosphatase / rhaBAD promoter / Fermentation / Multivariate Studie / design of experiments / ICP-OES
Schlagwörter (EN)Quality by Design / E. coli / alkaline phosphatase / rhaBAD promoter / fermentation / multivariate study / design of experiments / ICP-OES
Schlagwörter (GND)Escherichia coli / Fermentation / Pharmazeutische Industrie / Prozessoptimierung
URNurn:nbn:at:at-ubtuw:1-40923 Persistent Identifier (URN)
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Quality by design for process understanding- multivariate studies on a recombinant E. coli expression system [3.12 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Die vorliegende Arbeit zeigt exemplarisch einen "Quality by Design" Ansatz für ein rekombinantes Expressionssystem. Eine multivariate Studie mit den Faktoren Induktionstemperatur, Induktionszeit und Induktions-Fütterungsstrategie wurde an einem rhamnoseinduzierbaren E. coli Expressionssystem (rhaBAD Promoter) zur intrazellulären Produktion von Alkalischer Phosphatase durchgeführt. Die experimentelle Durchführung der notwendigen Fermentationen erfolgte in einem voll instrumentierten 10 Liter Bioreaktor. Als Hilfsmittel für die Versuchsplanung- und Durchführung diente Design of Experiments (DoE).

Als Qualitätsattribut wurde die Biomasse spezifische Aktivität (U/g Biomass) definiert. Höchste spezifische Aktivitäten konnten bei einer Induktionstemperatur von 27.5C und einer positiv exponentiellen Fütterungsstrategie nach 10 Stunden Induktion gefunden werden. Um Verständnis für dieses Verhalten zu erlangen, wurden die aufgenommenen Daten (Biomasse, extrazelluläres Protein, Daten aus Abgasanalyse und Waagensignale) in spezifische Raten und Ausbeuten prozessiert. Diese wiederum wurden mit den Parametern der multivariaten Studie multilinear regressiert. Dieser Ansatz lieferte Prozesswissen über das untersuchte System. Es konnten Hinweise auf eine Down-Regulierung des Expressionssystems durch den Prozessparameter Temperatur gefunden werden. Weiters korrelierte die spezifische Protein Abgabe Rate mit der Fütterungsstrategie. Bei einer höheren Fütterungsstrategie wurde weniger Proteinabgabe detektiert, was sich folglich positiv auf die intrazelluläre Aktivität des Zielproteins auswirkte. Weiters wurde das Medium im Verlauf der Fermentation mit Hilfe von ICP-OES untersucht, wodurch Hinweise auf eine Zinklimitation gefunden wurden.

Zusammenfassung (Englisch)

This contribution exemplifies a quality by design (QbD) approach for the characterization of a high density E. coli recombinant upstream process, investigating the multivariate interactions of three critical process parameters (CPPs) in respect to their impact on product quality using statistical experimental design and multivariate modelling.

Intracellular production of alkaline phosphatase by means of the little studied positively regulated rhaBAD promoter was chosen as a model system. The multivariate study included the induction phase feeding strategy, expressed as the feed-exponent k (-0.007; 0; +0.007), induction temperature (20C; 27.5C; 35C) as well as induction time (10 to 40 hours of induction) as presumptive critical process parameters (CPPs) under investigation. Based on a sequential approach for upstream design space development, the upstream critical quality attribute (CQA) was defined in respect to downstream demands (specific activity; U/gbiomass). Optimal operating conditions for the process were found at medium temperatures (27.5C) and at a positive exponential feeding strategy. The result was the establishment of a knowledge space. The physiological impact of the critical process parameters on the culture was further evaluated by multi-linear regression of yields and specific rates with CPPs. This methodology revealed the protein release, expressed as the biomass specific protein release rate, to be correlating with the applied feeding strategy as well as product quality, making it critical for intracellular protein production. Lower induction temperatures increased the biomass yield, possibly due to a down regulation of recombinant protein expression. The biomass yield declined within induction time, indicating a rise in maintenance metabolism. This was found to go along with an increase in the carbon dioxide yield, independent of temperature and feeding strategy. The multivariate study gave evidence that specific activities are starting to decline after ten hours of induction, although SDS gel electrophoresis indicated that alkaline phosphatase levels were still increasing. Zinc, essential for folding and function of alkaline phosphatase (Torriani 1968), was monitored via ICP-OES, which gave evidence for a zinc limitation that explains the observed decrease in activities after 10 hours of induction.