Titelaufnahme

Titel
The effect of tyrosine kinase 2 (Tyk2) deficiency on primary murine macrophages monitored by qualitative and quantitative proteomic analysis / von Tom Grunert
VerfasserGrunert, Tom
Begutachter / BegutachterinAllmaier, Günter ; Müller, Mathias
Erschienen2009
Umfanggetr. Zählung : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Techn. Univ. u. Vet.-Med. Univ., Diss., 2009
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Tyrosine Kinase 2 / Immunsystem / Metabolismus / Maus / Makrophagen / Serum / Proteomics / Elektrophorese / Massenspektrometrie / Qualitätskontrolle
Schlagwörter (EN)Tyrosine Kinase 2 / immunity / metabolism / mouse / macrophages / serum / proteomics / electrophoresis / mass spectrometry / quality control
Schlagwörter (GND)Protein-Tyrosin-Kinasen / Makrophage / Proteomanalyse
URNurn:nbn:at:at-ubtuw:1-29283 Persistent Identifier (URN)
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The effect of tyrosine kinase 2 (Tyk2) deficiency on primary murine macrophages monitored by qualitative and quantitative proteomic analysis [3.32 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Tyrosine Kinase 2 (Tyk2) ist an der intrazellulären Signalübertragung bei einer großen Anzahl von Zytokinen beteiligt. Das Ziel der durchgeführten Studie war, das Wissen um die molekulare Funktion von Tyk2 in Makrophagen zu erweitern. Die von uns verwendete Strategie basierte auf 2-dimensionaler differentieller Gel-Elektrophorese (2D-DIGE) für die Proteinquantifizierung und Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisation-Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) in Kombination mit Bioinformatik für die Proteinidentifizierung.

Immunologische und enzymatisch-colorimetrische Analysen wurden für die Verifizierung und für detailliertere biologische Studien angewendet. Das Proteom der Makrophagen wurde vor und nach Stimulation mit poly(I:C), welches die Anwesenheit mikrobieller doppel-strängiger RNA simuliert, untersucht. Die gewonnenen Daten unterstreichen die bedeutende Rolle von Tyk2 für die Regulation der zellularen Immunantwort. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Tyk2 die Regulation von einigen Proteinen und deren Isoformen des Fett- und Kohlenhydratstoffwechsels nach Behandlung mit poly(I:C) beeinflusst. Der Einfluss von Tyk2 auf Stoffwechselwege konnte durch Cholesterin- und Laktatmessungen bestätigt werden. Die Ergebnisse dieser Studie zeigten erstmals, dass Tyk2 bei der molekularen Kommunikation zwischen Immunantwort und Metabolismus eine Rolle spielt. Des Weiteren trug diese Arbeit zur Identifizierung von Proteinen in Tyk2-defizienten Makrophagen nach Behandlung mit Lipopolysaccharid, einem Hauptbestandteil der äußeren Zellwand von Gram-negativen Bakterien, bei. 27 Proteine inklusive deren Isoformen wurden eindeutig mittels MALDI-TOF-MS und Bioinformatik identifiziert und konnten verschiedenen funktionalen Kategorien (z.B. Immunantwort, oxidativer Stress, Metabolismus und zytoskeletale Architektur) zugeordnet werden.

Zum Schluss wurde ein methodischer Vergleich von zwei schnellen Techniken für die Beurteilung von Proteomproben (z.B. aus Körperflüssigkeiten gewonnen), die besonders anfällig für technische Artefakte (z.B. enzymatischer Abbau) sind, durchgeführt. SDS-PAGE und Kapillargelelektrophorese-am-Chip stellten sich beide als geeignete Methoden für eine schnelle Qualitätskontrolle vor komplexen MS-basierenden Analysen heraus. Unterschiede zwischen den Proteomproben konnten einfacher in der SDS-PAGE visuell beobachtet werden, jedoch Zeitaufwand, Probenverbrauch und die statistische Auswertung solcher Bilder, geben der Kapillargelelektrophorese-am-Chip den Vorzug.

Zusammenfassung (Englisch)

Tyrosine kinase 2 (Tyk2) is involved in the intracellular signal transduction of a large number of cytokines. The aim of the presented studies is to improve our understanding of the molecular function of Tyk2 in macrophages using two-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) for protein quantification and matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) in combination with bioinformatic tools for protein identification.

Immunological and enzymatic-colorimetric analyses were employed for further verification and more detailed biological investigations.

The macrophage proteome was investigated before and after treatment with poly(I:C), which mimics the presence of microbial double-stranded RNA.

Data emphasise the important role of Tyk2 for the regulation of cellular immune responses and further show that Tyk2 influences the abundance of proteins (incl. isoforms) involved in lipid and carbohydrate metabolism after poly(I:C) treatment. The participation of Tyk2 in metabolic pathways was shown by cholesterol and lactate measurements. The results provide evidence for a novel function of Tyk2 linking metabolic and immune response networks.

This work further contributed to the identification of proteins in Tyk2-deficient macrophages after lipopolysaccharide treatment, a major component of the outer membrane of Gram-negative bacteria. 27 proteins (incl. isoforms) were unambiguously identified by MALDI-TOF-MS/bioinformatics and assigned to various functional categories including immune response, oxidative stress, metabolism and cytoskeleton architecture.

Finally, the fast quality control of protein samples (e.g. derived from body fluids) which are prone to technical artefacts (e.g. enzymatic degradation) was studied by two techniques. SDS-PAGE and capillary gel electrophoresis (CGE)-on-the-chip were both suitable as pre-screening methods for a fast quality evaluation prior to complex MS-based analysis. Differences between samples were easily observed on SDS-PAGE images, but time consumption, sample amount and statistical evaluation were in favour of the technique CGE-on-the-chip.