Molecular and physiological investigations of biocontrol by the genus Hypocrea/Trichoderma

Abstract

Spezies des filamentösen Pilzes Hypocrea/Trichoderma werden in der Landwirtschaft aufgrund ihrer mykoparasitischen Wirkung gegen pflanzenpathogene Pilze und positiven Effekte auf das Pflanzenwachstum und die Wurzelbildung als biologische Pflanzenschutzmittel eingesetzt.<br />Aspekte die in Zusammenhang mit den verschiedenen Schritten des mykoparasitischen Angriffs stehen, wurden untersucht. Die Polyol-Konzentrationen von H. atroviridis wurden während normalem Hyphenwachstum und verschiedenen Arten von osmotischem Stress untersucht. Biosynthese von Glyzerin während osmotischem Stress erfolgte mittels der Glyzerindehydrogenase (Gld1). Der STRE-(Stress-Element) bindende Transkriptionsfaktor Seb1 war zwar in die osmotische Stressreaktion involviert, jedoch nicht essentiell für diese.<br />Untersuchungen zur Biokontrollwirkung von H. jecorina QM9414 zeigten einen starken Antagonismus in Plattenkonfrontationstests und auch statistisch signifikante, obwohl eher schwache, Biokontrollwirkung in Pflanzenversuchen gegen Pythium ultimum aber nicht gegen Rhizoctonia solani. Eine Zellulase-negative H. jecorina Mutante zeigte ähnlichen Antagonismus in Agarplatten und ähnliche Pflanzenschutzwirkung und eine Kohlenstoff-dereprimierte H. jecorina Mutante antagonisierte P. ultimum in Agarplatten besser und erhöhte auch die Überlebensrate von mit P.<br />ultimum beimpften Zucchinipflanzen verglichen mit H. jecorina QM9414.<br />Die H. jecorina Genomdatenbank wurde benutzt, um einen umfangreichen Einblick in das chitinolytische Potential von Hypocrea/Trichoderma zu bekommen. Das H. jecorina Genom enthält 18 Gene die für Chitinasen kodieren, elf dieser Gene kodieren für bisher nicht beschriebene Chitinasen. Fünf neue Chitinase-Gene wurden aus H. atroviridis kloniert.<br />Die Transkription von chi18-10 (das zu Gruppe C, einer neuen phylogenetischen Untergruppe von Chitinasen mit Ähnlichkeit zu Kluyveromyces lactis Killertoxinen gehört) und chi18-13 (das zur neuen Untergruppe B gehört) wurde spezifisch bei Wachstum auf R. solani Zellwänden, und bei Plattenkonfrontationen mit R. solani erhöht. beta-N-Acetylglucosaminidase-Aktivitäten von H. atroviridis wurden auf 95 verschiedenen Kohlenstoffquellen analysiert. Die Ergebnisse zeigten eine wachstumsabhängige Expression von beta-N-Acetylglucosaminidasen und erhöhte beta-N-Acetylglucosaminidase-Aktivitäten auf Kohlenstoffquellen mit strukturellen Ähnlichkeiten, besonders auf alpha-Glukanen (z.B. Glykogen, Dextrin und Maltotriose) und auf Oligosacchariden die Galaktose enthielten. Die Reduktion der beta-N-Acetylglucosaminidase-Aktivitäten in einer H. atroviridis Delta-nag1 Mutante war stark Kohlenstoffquellen- und wachstumsabhängig, was darauf hindeutet, dass diese Gene verschiedene physiologische Aufgaben besitzen.

Species of the filamentous fungus Hypocrea/Trichoderma are used in agriculture as biocontrol agents due to their mycoparasitic action against plant pathogenic fungi and their beneficial effects on plant growth and root development. Aspects of the steps that are involved in the mycoparasitic attack were investigated.<br />The polyol pools of H. atroviridis during normal growth and different kinds of osmotic stress were analysed. Glycerol biosynthesis occurred via the glycerol dehydrogenase (Gld1). The STRE (stress element)-binding transcription factor Seb1 was only involved in, but not essential for the osmotic stress response.<br />Investigation of the biocontrol potential of H. jecorina demonstrated good antagonism of H. jecorina against Pythium ultimum in plate confrontation assays and also statistically significant, albeit rather weak, biocontrol action in greenhouse experiments, but not against Rhizoctonia solani. A cellulase negative H. jecorina mutant showed a similar range of antagonism in plates and plant protection and a carbon catabolite derepressed H. jecorina mutant antagonized P. ultimum on plates more actively and also increased the survival rates of P.<br />ultimum-inoculated zucchini plants. The H. jecorina genome database was used for a comprehensive study of the chitinolytic potential of Hypocrea/Trichoderma. The H. jecorina genome contains 18 ORFs encoding putative chitinases, all of them belonging to glycoside hydrolase family 18. Eleven of them encode yet undescribed chitinases. Five novel chitinase genes were subsequently cloned from H. atroviridis. Transcription of chi18-10 (belonging to group C, a novel phylogenetic subgroup of chitinases with similarity to Kluyveromyces lactis killer toxins) and chi18-13 (belonging to a novel clade in group B) was triggered upon growth on R. solani cell walls, and during plate confrontation tests with R. solani. beta-N-acetylglucosaminidase activities of H. atroviridis were analysed on a set of 95 different carbon sources. The results showed that the expression of beta-N-acetylglucosaminidases was not restricted to mycoparasitism-related growth conditions but could be found on most carbon sources and was shown to be dependent on the growth-rate.<br />Additionally, beta-N-acetylglucosaminidase activities were enhanced on carbon sources sharing certain structural properties, especially on alpha-glucans (e.g. glycogen, dextrin and maltotriose) and oligosaccharides containing galactose. Reduction of beta-N-acetylglucosaminidase levels in a H. atroviridis Delta-nag1 mutant was strongly carbon source and growth phase dependent, indicating distinct physiological roles of those genes.