Titelaufnahme

Titel
Determination of Fusarium mycotoxins and study of their metabolism in plants with HPLC-tandem mass spectrometry / Franz Berthiller
VerfasserBerthiller, Franz
Begutachter / BegutachterinKrska, Rudolf ; Adam, Gerhard
Erschienen2005
UmfangGetr. Zählung : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Techn. Univ., Diss., 2006
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Fusarium / Mykotoxine / Metabolismus / Pflanzen / HPLC / Massenspektrometrie
Schlagwörter (EN)Fusarium / mycotoxins / metabolism / plants / HPLC / mass spectrometry
Schlagwörter (GND)Fusarium / Mykotoxin / Metabolit / Pflanzen / HPLC-MS
URNurn:nbn:at:at-ubtuw:1-15943 Persistent Identifier (URN)
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Determination of Fusarium mycotoxins and study of their metabolism in plants with HPLC-tandem mass spectrometry [11.18 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Diese Dissertation ist der Bestimmung von bedeutenden Mykotoxinen, welche von Fusarium Pilzen gebildet werden, und deren Metaboliten in Pflanzen mittels Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) gewidmet.

Das Hauptaugenmerk der Dissertation lag auf der Entwicklung von LC-MS/MS Methoden um das konjugierte Mykotoxin Deoxynivalenol-3-Glukosid (D3G) zu analysieren und deren Anwendung um die Rolle von D3G in Pflanzen zu bestimmen. D3G wurde zunächst chemisch synthetisiert und später aus Deoxynivalenol (DON) behandeltem Weizen isoliert um analytische Standards zu erhalten. Diese Substanz wurde mittels Tandem-Massenspektrometrie und Kernspin-Magnetresonanz-Spektroskopie charakterisiert. Es wurde gezeigt, dass eine Arabidopsis thaliana Glukosyltransferase (DOGT1) in der Lage ist, DON in D3G umzuwandeln und dadurch die Phytotoxizität von DON drastisch zu reduzieren. Diese Reaktion tritt auch in Weizen auf und es konnte festgestellt werden, dass der "quantitative trait locus (QTL)" Qfhs.ndsu-3BS mit dieser Umwandlung verknüpft ist. Da Qfhs.ndsu-3BS einen wichtigen QTL für die Resistenzzüchtung von Weizen darstellt, erwarten wir große Einflüsse unserer Ergebnisse auf dieses ökologisch und ökonomisch wichtige Gebiet.

D3G konnte auch in natürlich kontaminierten Weizen- und Maisproben in Konzentrationen von 4% bis 12% des jeweiligen DON-Gehaltes gefunden werden. Hierdurch konnte erstmals eine konjugierte Form von DON in Feldfrüchten detektiert werden. Die entwickelten Methoden zur Quantifizierung von D3G könnten in Zukunft noch wichtiger werden, da der verstärkte Einsatz von Fusarium resistenten Getreidesorten auch den Anteil von D3G in solchen Pflanzen erhöhen könnte. Die Lebensmittelsicherheit betreffend sind fortführende Studien nötig um die Bioverfügbarkeit von D3G für Mensch und Tier, nach der potentiellen Freisetzung von DON durch Darmbakterien, abzuklären.

Ferner wurde der Metabolismus von Zearalenon (ZON) in Arabidopsis thaliana untersucht. Pflänzlinge wurden in ZON versetztem Flüssigmedium gezogen, extrahiert und mittels LC-MS/MS analysiert. In Summe konnten 17 verschiedene Substanzen, davon 10 bisher unbeschriebene, identifiziert werden die alle Metaboliten von ZON waren. Im speziellen wurden Glukoside, Malonyl-Glukoside, Dihexoside und Hexose-Pentose-Disaccharide von ZON, [alpha]ZOL und [beta]ZOL detektiert sowie ein metabolisches Schema vorgeschlagen.

Zusätzlich wurde eine schnelle Methode zur gleichzeitigen Bestimmung von wichtigen Fusarium Mykotoxinen in Getreide mittels LC-MS/MS entwickelt und validiert. Die B-Trichothecene Nivalenol, DON, Fusarenon-X und 3-Acetyl-DON werden dabei im negativen Ionenmodus der verwendeten "atmospheric pressure chemical ionization" Quelle gemessen. Ein Änderung der Polarität zum positiven Ionenmodus erlaubt die anschließende Bestimmung der A-Trichothecene Diacetoxyscirpenol, HT-2 Toxin und T-2 Toxin, bevor ZON erneut im negativen Modus bestimmt wird. Dieser Aufbau erlaubt Detektionslimits im sub-ppb- bzw. im niedrigen ppb-Bereich in Getreide und resultierte in der ersten validierten LC-MS/MS Methode zur Bestimmung dieser Toxine. Bis heute wurden über 2.200 Proben erfolgreich mit dieser Methode in unserem Institut gemessen.

18 international begutachtete Publikationen konnten erstellt werden, wovon 8 den Kern dieser Dissertation formen. Weitere 10 nationale Publikationen, 10 Poster und 11 Vorträge des Autors über die oben angeführten Themen waren darauf abgerichtet unsere Ergebnisse zu verbreiten. Schlussendlich wurde ein bedeutender Beitrag geleistet um ein weltweites Patent über die Entgiftung von Mykotoxinen mittels Glukosyltransferasen zu erlangen.

Zusammenfassung (Englisch)

This thesis was devoted to the determination of major mycotoxins, produced by Fusarium fungi, and their metabolites in plants using high-performance liquid chromatography - tandem mass spectrometry (LC-MS/MS).

The major focus of the thesis was the development of LC-MS/MS methods for the determination of the conjugated mycotoxin deoxynivalenol-3-glucoside (D3G) and their use for the elucidation of the role of D3G in plants. D3G was first chemically synthesized and later isolated from deoxynivalenol (DON) treated wheat to obtain analytical standards. This substance was characterized by means of tandem mass spectrometry and nuclear magnetic resonance experiments. An Arabidopsis thaliana glucosyltransferase (DOGT1) has been shown to convert DON to D3G and to dramatically decrease the phytotoxicity of DON that way. The same reaction also occurs in wheat and the quantitative trait locus (QTL) Qfhs.ndsu-3BS was found to be linked to this conversion. As Qfhs.ndsu-3BS is a major QTL for resistance breeding of wheat, we expect our results to have a huge impact in this ecological and economical important area. D3G was also found in naturally contaminated wheat and maize samples at concentrations between 4% to 12% of the respective DON concentrations. It was the first time that a conjugated form of DON was detected in field crops. The developed methods for the quantification of D3G will likely become more important in the future, as the increased use of Fusarium resistant cultivars might also increase the ratio of D3G in such plants. Regarding food safety, further studies are needed to verify the bioavailability of D3G for man and animal after the potential release of DON by gastrointestinal microorganisms. Furthermore, the metabolism of zearalenone (ZON) was examined in Arabidopsis thaliana. Plant seedlings were grown in ZON treated liquid medium, extracted and analyzed by LC-MS/MS. A total of 17 different substances, including 10 previously undescribed ones, were identified, all of which were metabolites of ZON. Particularly, glucosides, malonyl-glucosides, dihexosides and hexose-pentose-disaccharides of ZON, [alpha]ZOL and [beta]ZOL were detected and a metabolism scheme was proposed.

In addition, a rapid method for the simultaneous determination of major Fusarium mycotoxins in cereals by LC-MS/MS was developed and validated.

The B-trichothecenes nivalenol, DON, fusarenon-X and 3-acetyl-DON are measured in the negative ion mode of the used atmospheric pressure chemical ionization source. A polarity switch then allows to measure the A-trichothecenes diacetoxyscirpenol, HT-2 toxin and T-2 toxin in the positive ion mode, before switching back to negative ionization for the measurement of ZON. This setup grants method detection limits in the sub-ppb or low-ppb range in cereals and resulted in the first ever validated LC-MS/MS method for the simultaneous quantification of these toxins. Over 2.200 samples have been measured successfully with this method in our institute up to date.

18 international peer reviewed publications have been generated, 8 of which are forming the very core of this thesis. Another 10 national publications, 10 posters and 11 oral presentations given by the author about the upper topics aimed to disseminate our results. Finally, a major contribution has been given to achieve a worldwide patent about the detoxification of mycotoxins with the use of glucosyltransferases.