Titelaufnahme

Titel
BioID: Evaluation of a new method for protein-protein interactions in Trichoderma reesei / Melanie Reitmaier
Weitere Titel
BioID: Evaluation einer neuen Methode für Protein-Protein Interaktionen in Trichoderma reesei
VerfasserReitmaier, Melanie
Begutachter / BegutachterinSeiboth, Bernhard ; Ramoni, Jonas
ErschienenWien 2016
Umfang69 Seiten : Illustrationen
HochschulschriftTechnische Universität Wien, Univ., Diplomarbeit, 2016
Anmerkung
Zusammenfassung in deutscher Sprache
Abweichender Titel nach Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers
SpracheEnglisch
DokumenttypDiplomarbeit
Schlagwörter (DE)BioID / Trichoderma reesei / Biotechnologie / Zellulase / Protein-Protein Interaktion
Schlagwörter (EN)BioID / Trichoderma reesei / Biotechnologie / Zellulase / Protein-Protein Interaktion
URNurn:nbn:at:at-ubtuw:1-2915 Persistent Identifier (URN)
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BioID: Evaluation of a new method for protein-protein interactions in Trichoderma reesei [2.26 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Der filamentöse Pilz Trichoderma reesei ist einer der wichtigsten Produzenten von (hemi)zellulolytischen Enzymen und spielt daher eine wichtige Rolle in unterschiedlichen industriellen Anwendungen, wie zum Beispiel in der Papier-, Lebensmittel-, Tierfutter- und Textilindustrie oder für die Saccharifikation von Lignozellulose-Biomasse zu einfachen Zuckern für die Herstellung von biobasierenden Produkten wie Biokraftstoffen. Obwohl T. reesei große Mengen an Zellulasen sekretieren kann, sind weitere Forschungen notwendig, um die Effizienz zu steigern und die Kosten der Zellulaseproduktion zu senken. Ein Weg die Kosten der Zellulaseproduktion zu minimieren sind Stammverbesserungsmethoden. Ziel dieser Diplomarbeit war es, eine neue Methode, namens BioID, welche Protein-Protein Interaktionen detektiert, in vivo in T. reesei zu untersuchen. Nähe-basierende Biotin Identifikation (BioID) detektiert Proteininteraktionen in lebenden Zellen und verwendet dazu eine mutierte Biotinligase, BirA*, welche benachbarte Proteine biotinyliert. Um Interaktionspartner der beiden Zellulaseregulatoren XYR1 und LAE1 zu detektieren, wurde das BirA* Ligase kodierende Gen an das xyr1 und lae1 Gen fusioniert und mittels homologer Rekombination an ihren entsprechenden Genlokus integriert. Phenotypische Analysen der birA* getaggten xyr1 und lae1 Stämme zeigten, dass weder Wachstum und Sporulation, noch die Enzymproduktion beeinflusst wurden, was wiederum zeigt, dass beide Regulatoren in ihrer physiologischen Funktion nicht beeinträchtigt sind. Obwohl unterschiedliche Kohlenhydratquellen, Biotinkonzentrationen und Probenzeitpunkte getestet wurden, um neubiotinylierte Proteine in den Proteinextrakten von T. reesei zu detektieren, konnte keine Biotinylierung nach einer Biotinzugabe beobachtet werden. Die getaggten XYR1 und LAE1 Proteine waren auch durch Western blotting nicht detektierbar, was auf eine niedrige Expression oder auf den Abbau des BirA*-Tags hindeuten könnte. Genexpressionsstudien zeigten, dass lae1 auf Laktose nicht hochreguliert ist, im Vergleich zur reprimierenden Kohlenhydratquelle Glukose, hingegen zeigte xyr1 eine starke Hochregulierung unter denselben Bedingungen. Diese Ergebnisse zeigen, dass BioID nicht ohne weiteres zur Detektion von Protein-Protein Interaktionen in T. reesei verwendet werden kann und weitere Experimente nötig sind um die Aktivität, Expression und Stabilität von BirA* zu testen.

Zusammenfassung (Englisch)

The filamentous fungus Trichoderma reesei is one of the most important producers of (hemi)cellulolytic enzymes and plays an important role in different industrial applications including the paper, pulp, food, animal feed and textile industry or for saccharification of lignocellulosic biomass into simple sugars for the production of bio-based products including biofuels. Although T. reesei is able to secrete high level of cellulases further efforts are necessary to maximize efficiency and yield and minimize costs of enzyme production. One way towards lower costs of cellulase production is via strain improvement. Aim of this thesis was to evaluate the novel method BioID to study protein-protein interactions in vivo in T. reesei. Proximity-based biotin identification screens for protein interactions in living cells and uses a mutated biotin ligase BirA*, which biotinylates proximal proteins. This enables their isolation by biotin-affinity capture. To screen for interaction partners of the two cellulase-regulators XYR1 and LAE1 the BirA* ligase encoding gene was fused to xyr1 and lae1 and the different gene fusion constructs were targeted to their respective gene locus by homologous recombination. Phenotypical analyses of the birA* tagged xyr1 and lae1 strains showed that tagging did not influence growth, sporulation or enzyme production indicating that the two regulators are not impaired in their physiological function. Different cellulase inducing carbon sources, biotin concentrations and sampling time points were tested to detect newly biotinylated proteins in the protein extracts of T. reesei. However, no biotinylation was detected following biotin addition. The tagged XYR1 and LAE1 proteins were also not detectable by western blotting, indicating low expression or a degradation of the BirA* tag. Gene expression studies showed that lae1 was not upregulated on the cellulase expressing carbon source lactose in comparison to the repressible carbon source glucose while xyr1 was highly upregulated. These results show that BioID cannot be readily used to detect protein-protein interactions in T. reesei and further experiments are required to test the activity, expression and stability of BirA*.