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Title
Expression tuning in Escherichia coli via a glucose/lactose mixed feed system / Julian Quehenberger
Additional Titles
Regelung der Proteinexpression in E. coli auf zellulärer Ebene mit Hilfe eines gemischten Glucose/Lactose-Feedsystems
AuthorQuehenberger, Julian
CensorSpadiut, Oliver ; Wurm, David Johannes
PublishedWien, 2016
Description86 Seiten : Illustrationen
Institutional NoteTechnische Universität Wien, Univ., Diplomarbeit, 2016
Annotation
Zusammenfassung in deutscher Sprache
Abweichender Titel nach Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers
LanguageEnglish
Document typeThesis (Diplom)
Keywords (EN)E. coli / lactose / mixed feed / expression tuning / cellular level / flow cytometry / all-or-non induction / substrate uptake rate / recombinant protein expression
URNurn:nbn:at:at-ubtuw:1-404 Persistent Identifier (URN)
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Expression tuning in Escherichia coli via a glucose/lactose mixed feed system [2.23 mb]
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Abstract (German)

Kurze Produktionsphase aufgrund von hoher Stoffwechselbelastung und Bildung von unlöslichen Einschlusskörperchen sind bekannte Einschränkungen für die rekombinante Proteinproduktion in Escherichia coli. Zum heutigen Zeitpunkt wird die Lösung dieser Problemen vor allem mittels Methoden der Gentechnik in Angriff genommen. In der vorliegenden Arbeit werden die folgenden Fragestellungen behandelt: (1) die Übertragbarkeit der Beziehung zwischen der Glucose- und Lactoseaufnahme bei Glucoselimitierung und gleichzeitigem Lactoseüberschuss wird geprüft. Dazu werden die spezifischen Substrataufnahmeraten zweier E. coli Stämme BL21(DE3), welche unterschiedliche Zielproteine unter der Kontrolle des T7lac Promoters exprimieren, verglichen; (2) die Regelung der Rate der rekombinanten Proteinproduktion und das Verhältnis von gelöstem Protein zu Protein in Einschlusskörperchen wird untersucht; (3) die Stärke der Induktion bei Lactosefütterung wird auf zellulärer Ebene untersucht. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die maximale spezifische Lactoseaufnahmerate stark von der Expression des Zielproteins beeinflusst wird. Weiters kann aus den Resultaten geschlossen werden, dass eine Induktion mit Laktose durch eine limitierende Fütterungsstrategie mit Glucose und Lactose die Rate der rekombinanten Proteinproduktion und das Verhältnis von gelöstem Protein zu Protein in Einschlusskörperchen steigern kann. Gleichzeitig ist es damit möglich die Ausbildung von unterschiedlich stark induzierten Subpopulationen zu vermeiden. Diese Ergebnisse werden den Forderungen der pharmazeutischen Industrie gerecht, effizient hohe Erträge an aktivem Zielprotein zu erreichen und dabei potentiell die Produktionsphase durch Reduktion der Stoffwechselbelastung der produzierenden Zellen auszuweiten.

Abstract (English)

Short production phases due to high metabolic burden and formation of insoluble inclusion bodies are known limitations for recombinant protein production in Escherichia coli. Up to now, these issues are mainly tackled by genetic engineering. In this work the following issues are studied: (1) the transferability of the relationship between the specific uptake rates of glucose and lactose during their concomitant uptake is investigated. Therefore specific substrate uptake rates of two E. coli BL21(DE3) strains producing different target proteins under the control of the T7lac promotor system are compared during limiting glucose concentrations, while lactose was available in excess; (2) the tunability of the recombinant protein production rate and the ratio of soluble protein (SP) to inclusion bodies (IBs) are assessed; (3) the degree of induction during lactose feeding is investigated on the cellular level. The results of this Thesis show that the maximum specific lactose uptake rate is strongly influenced by the expressed target protein. Furthermore it can be concluded that lactose induction via a limiting mixed feeding strategy can increase the recombinant protein production rate and the ratio of SP to IBs while differently induced subpopulation can be avoided. This meets the demands of pharmaceutical bioprocesses to efficiently yield high amounts of active target protein and to extend the production phase by reducing metabolic burden and enhancing cell fitness.