dc.description.abstract
The industrially applied (Buchert, Oksanen et al. 1998; Galante, De Conti et al. 1998; Galante, De Conti et al. 1998) soft rot fungus Trichoderma reesei (an anamorph of Hypocrea jecorina) is a very efficient producer of wood degrading enzymes, the enzymatic spectrum comprising of cellulases (CBH I, CBH II, CBH III), -glucosidases (BGL I, BGL II), endoglucanases (EG I, EG II, EG III, EG V, EG VII), xylanases (XYN I, XYN II) and several debranching enzymes (ABF I, GLR I, AXE I, AE). The fungus secretes up to 60 g/l protein upon induction of the cellulolytic system, 70% of which are cellulases, the most abundant single protein being CBH I (about 60% of the total amount of protein secreted (Fowler, Grizaldi et al. 1993)). Hence the regulation of the protein production in this fungus has received much attention. But nevertheless up to now relatively little is known about how the production of extracellular proteins is controlled. Only four genes (cbh1, cbh2, xyn1, xyn2) have been investigated in some detail with regard to the processes going on at the molecular level (Stangl, Gruber et al. 1993; Ilmén, Onnela et al. 1996; Mach, Strauß et al. 1996; Zeilinger, Mach et al. 1996; Zeilinger, Mach et al. 1998; Zeilinger and Mach 1998; Zeilinger, Haller et al. 2000; Saloheimo, Aro et al. 2000; Aro, Saloheimo et al. 2001). For these depolymerising enzymes it has been shown that the control of their synthesis is exerted on the transcriptional level (Shoemaker, Schweickart et al. 1983; Teeri, Salovouri et al. 1983; Teeri, Lehtovaara et al. 1987; Penttilä, Lehtovaara et al. 1986; Saloheimo, Lehtovaara et al. 1988; El-Gogary, Leite et al. 1989; Messner and Kubicek 1991; Fowler and Brown 1992; Morawetz, Gruber et al. 1992; Penttilä, Saloheimo et al. 1993; Ilmén, Onnela et al. 1996; Mach, Strauß et al. 1996; Zeilinger, Mach et al. 1996; Zeilinger and Mach 1998; Zeilinger, Mach et al. 1998; Zeilinger, Haller et al. 2000; Margolles-Clark, Ilmén et al. 1997; Würleitner, Pera et al. 2002). Factors that have been found to regulate the expression of these genes and which have been cloned are Cre1 (Strauß, Mach et al. 1995; Ilmén, Thrane et al. 1996), ACE I (Saloheimo, Aro et al. 2000), ACE II (Aro, Saloheimo et al. 2001) and the HAP 2/3/5 complex (Zeilinger, Ebner et al. 2001). Cre1 and ACE I act as repressors of transcription (Mach, Strauß et al. 1996; Aro, Ilmén et al. 2003; Takashima, Iikura et al. 1996; Ilmén, Onnela et al. 1996; Strauß, Mach et al. 1995) whereas ACE II and in some cases also the HAP 2/3/5 promote gene expression (Aro, Saloheimo et al. 2001; Aro, Ilmén et al. 2003; Zeilinger, Mach et al. 1998; Zeilinger, Ebner et al. 2001). In other cases the HAP 2/3/5 complex can also reduce the transcriptional activity of a gene (Würleitner, Pera et al. 2002). The different effects resulting from HAP 2/3/5 binding might be related to the respective overall promoter structure and the distance of the CCAAT box to the transcription start, as the complex has been shown to influence the positioning of nucleosomes (Narendja, Davies et al. 1999). This work presents another novel transcriptional activator named Xyr1, a (Zn2+)2·Cys6 zinc cluster protein of the GAL4 type which is a homolog (47,2% identity) of the Aspergillus niger xylanase regulatory factor XlnR (van Peij, Visser et al. 1998) and indispensable for an elevated level of transcription of the xyn1 gene of T. reesei upon induction. The corresponding gene has been cloned and was analysed in detail. Also the effects of the cis acting elements of the xyn1 promoter were studied in vivo in this work, for the first time using the full-length promoter fragment. Two motifs have already been identified earlier to regulate the transcription of the gene. A Cre1 binding site responsible for carbon catabolite repression (Mach, Strauß et al. 1996) and a CCAAT box recruiting the HAP 2/3/5 complex (Zeilinger, Mach et al. 1996; (Mach 2002) ; Rauscher, Würleitner et al., manuscript in preparation). A third element exhibiting the consensus sequence of the A. niger XlnR binding site (GGCTAA) present in an inverted repeat was assumed to play a role in the regulation process as well (Wacenovsky 1998). By building reporter gene constructs carrying the xyn1 promoter in front of the glucose oxidase gene (goxA) from A. niger and introducing site directed mutations into the respective elements (XLNR, CCAAT, CRE) of the promoter it could be demonstrated that the XlnR like site (XLNR) and its corresponding trans acting factor (which is highly likely to be Xyr1) are essential for induction of XYN I expression in vivo and it could be confirmed that carbon catabolite repression is mediated by the double Cre1 site (CRE). The CCAAT box has also been proven to take part in the regulation, but not being able to influence the transcriptional level alone to a significant extent.
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dc.description.abstract
Der industriell eingesetzte (Buchert, Oksanen et al. 1998; Galante, De Conti et al. 1998; Galante, De Conti et al. 1998) Weichfäulepilz Trichoderma reesei (der Anamorph von Hypocrea jecorina) is ein höchst effizienter Produzent von holzabbauenden Enzymen, wobei das enzymatische Spektrum Cellulasen (CBH I, CBH II, CBH III), -Glucosidasen (BGL I, BGL II), Endoglucanasen (EG I, EG II, EG III, EG V, EG VII), Xylanasen (XYN I, XYN II) und einige seitenkettenabbauende Enzyme (ABF I, GLR I, AXE I, AE) umfaßt. Der Pilz sezerniert bei Induktion des Cellulase-Systems bis zu 60 g/l Protein, wovon 70% Cellulasen sind. Unter diesen ist das vorherrschende Protein CBH I (ungefähr 60% (Fowler, Grizaldi et al. 1993)). Daher wurde der Regulation der Proteinproduktion in diesem Pilz einiges an Aufmerksamkeit zuteil. Dennoch ist bis heute relativ wenig darüber bekannt, wie die Produktion extrazellulären Proteins kontrolliert wird. Nur vier Gene (cbh1, cbh2, xyn1, xyn2) wurden detaillierter dahingehend untersucht, was sich bei ihnen auf molekularer Ebene abspielt (Stangl, Gruber et al. 1993; Ilmén, Onnela et al. 1996; Mach, Strauß et al. 1996; Zeilinger, Mach et al. 1996; Zeilinger, Mach et al. 1998; Zeilinger and Mach 1998; Zeilinger, Haller et al. 2000; Saloheimo, Aro et al. 2000; Aro, Saloheimo et al. 2001). Für diese depolymerisierenden Enzyme wurde gezeigt, daß die Kontrolle ihrer Synthese auf Transkriptionsebene stattfindet (Shoemaker, Schweickart et al. 1983; Teeri, Salovouri et al. 1983; Teeri, Lehtovaara et al. 1987; Penttilä, Lehtovaara et al. 1986; Saloheimo, Lehtovaara et al. 1988; El-Gogary, Leite et al. 1989; Messner and Kubicek 1991; Fowler and Brown 1992; Morawetz, Gruber et al. 1992; Penttilä, Saloheimo et al. 1993; Ilmén, Onnela et al. 1996; Mach, Strauß et al. 1996; Zeilinger, Mach et al. 1996; Zeilinger and Mach 1998; Zeilinger, Mach et al. 1998; Zeilinger, Haller et al. 2000; Margolles-Clark, Ilmén et al. 1997; Würleitner, Pera et al. 2002). Faktoren, für die gefunden wurde, daß sie die expression dieser Gene steuern und die auch kloniert wurden, sind Cre1 (Ilmén, Thrane et al. 1996), ACE I (Saloheimo, Aro et al. 2000), ACE I (Aro, Saloheimo et al. 2001) und der HAP 2/3/5-Komplex (Zeilinger, Ebner et al. 2001). Cre1 und ACE I wirken als Repressoren der Transkription (Mach, Strauß et al. 1996; Aro, Ilmén et al. 2003; Takashima, Iikura et al. 1996; Ilmén, Onnela et al. 1996; Strauß, Mach et al. 1995), wohingegen ACE II und in einigen Fällen auch der HAP 2/3/5-Komplex die Genexpression ankurbeln (Aro, Saloheimo et al. 2001; Aro, Ilmén et al. 2003; Zeilinger, Mach et al. 1998; Zeilinger, Ebner et al. 2001). In anderen Fällen kann der HAP 2/3/5-Komplex auch die Transkriptionsaktivität reduzieren (Würleitner, Pera et al. 2002). Die unterschiedlichen Effekte, die aus der Bindung von HAP 2/3/5 resultieren könnten auch mit der jeweiligen Gesamtstruktur des Promotors und dem Abstand der CCAAT-Box zum Transkriptionsstart zusammenhängen, da gezeigt wurde, daß der Komplex die Positionierung von Nucleosomen beeinflußt (Narendja, Davis et al. 1999). In dieser vorliegenden Arbeit wird ein weiterer neuer Transkriptionsaktivator präsentiert, der Xyr1 benannt wurde, und der ein (Zn2+)2·Cys6 Zink-Cluster Protein ist, das zur Familie der GAL4-Faktoren gehört. Xyr1 ist homolog (47,2% Identität) zum Xylanase-Regulator XlnR aus Aspergillus niger (van Peij, Visser et al. 1998) und unverzichtbar für ein erhöhtes Transkriptionsniveau des xyn1-Gens aus T. reesei bei Induktion. Das entsprechende Gen wurde kloniert und im Detail analysiert. Auch die Effekte der cis-agierenden Elemente im xyn1-Promotor wurden in dieser Arbeit in vivo studiert, wobei zum ersten Mal der Promotor in voller Länge verwendet wurde. Zwei Motive waren bereits früher als Regulatoren der Expression dieses Gens identifiziert worden. Eine Cre1-Bindungsstelle, die für Kohlenstoff-Katabolit-Repression verantwortlich ist (Mach, Strauß et al. 1996) und eine CCAAT-Box, die den HAP 2/3/5-Komplex bindet (Zeilinger, Mach et al. 1996; Rauscher, Würleitner et al., Manuskript in Vorbereitung). Für ein drittes Element mit der Konsensus-Sequenz der A. niger XlnR-Bindungsstelle (GGCTAA), hier vorhanden als inverse Wiederholung, wurde ebenfalls eine Rolle im Regulationsprozeß vermutet (Wacenovsky 1998). Indem ein Reportergenkonstrukt angefertigt wurde, das den xyn1-Promotor vor dem Glucoseoxidase-Gen (goxA) aus A. niger enthält und durch das Einführen von spezifischen Mutationen in den einzelnen Elementen (XLNR, CCAAT, CRE) im Promotor konnte gezeigt werden, daß das der XlnR-bindenden Stelle ähnelnde Element (XLNR) und sein korrespondierender trans-agierender Faktor (der mit höchster Wahrscheinlichkeit Xyr1 ist), essentiell für die Induktion der Expression von XYN I in vivo ist und es konnte bestätigt werden, daß die Kohlenstoff-Katabolit-Repression durch die doppelte Cre1-Stelle (CRE) vermittelt wird. Ebenso konnte bewiesen werden, daß die CCAAT-Box ebenfalls an der Regulation beteiligt ist, wenn sie auch alleine das Transkriptionsniveau nicht signifikant beeinflussen kann.
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